广西巴马小型猪化素βlt;,agt;、βlt;,bgt;亚基基因成熟肽序列的克隆及原核表达.pdfVIP

广西巴马小型猪活化素B．、13。亚基基因 成熟肽序列的克隆及原核表达 摘要 是由两个B亚单位通过二硫键相连而形成的二聚体可溶性糖蛋白，主要功 脑一垂体一卵巢轴调控来调节哺乳动物生殖细胞的发育与成熟。另外，活化 素对体内不同组织细胞如肝脏、肾脏及肌肉等还有着广泛的调节功能。 本研究参照GenBank发表的猪活化素t3．、p。基因序列，对每个基因分 别设计两对特异性引物，分段扩增，然后拼接。以广西巴马小型猪发情母 应的cDNA片段。扩增片段纯化后，连接到pMDl8-T载体，转入DH5Q细 菌扩增，并测序。结果表明：扩增得到的activ；n且．基因序列为1472bp， 几乎包含了整个编码序列；而扩增得到的activin 13。为791bp，包含整个成 13 熟肽及部分信号肽DNA序列。同源性比较发现，广西巴马小型猪actjvin ．、B。与GenBank报道的猪activinB．、13。基因序列的同源性分别达到99．8 ％和99．6％，与奶牛、马及人等物种activin13．、B。基因序列的同源性 也达到了90％以上，说明克隆得到的actjvinB．、B。基因序列的正确性。 测序结果发现act；vinB．有5处发生了单个碱基的突变：即编码序列的第 13。有3个碱基发生了突变：即编码序列的第599位、732位及848位。 根据actiVin 13．、13。基因成熟肽序列，分别设计两对引物，并在上下 游弓l物上分别设计BamHI和EcoRI酶切位点，扩增actiVinB。、§。基因的 I和EcoR 成熟肽序列。经BamH I酶切分别将各个成熟肽序列定向连接到原 IPTG诱导表达ACT融合蛋自。经SOS和WesternBIotting分析，证 Vin 明已成功地表达了acti 13．、B。基因成熟肽序列的融合蛋白(各个片段 的大小约为20KD)，此融合蛋白以包涵体的形式表达，．有较高的表达量。诱 导条件优化发现。37C下培养，IPTG诱导的浓度为1mM．诱导5-8h有较好 的效果。 本研究成功克隆了广西巴马小型猪ACT两个亚基基因的部分cDNA序 一步研究活化素的生物学功能及为活化素在生产实践上的应用奠定了基 础。 关键词：广西巴马小型猪活化素活化素B．活化素9。融合蛋自 cDNA AND CLONING，SEQUENCEANALYSIS EXPRESSIONOF MATUREPEPTIDEDNA ACTIVIN BA／BB FROM MINI—PIG SEQUENCESGUANGⅪBAMA ABSTRACT oneof the Activin(ACT)is superfamily， transforminggrowth缸ctar-fl(TGF-m whichjs linked bondbetweentwomature adimedc byonedisulfide polypeptide in maturation subunits．Activinnot can