采用特异性探针药物法测定双峰驼CYP3A酶活性.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(16):3266-3274 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.16.016 采用特异性探针药物法测定双峰驼CYP3A酶活性 1 2 1，3 裴 乐 ，张文彬 ，哈斯苏荣 1 2 （内蒙古农业大学兽医学院/农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，呼和浩特 010018 ； 内蒙古阿拉善骆驼科学研究所， 3 内蒙古巴彦浩特 750300 ； 内蒙古骆驼研究院，内蒙古巴丹吉林 750300 ） 摘要：【目的】探究双峰驼CYP3A 酶体外活性及其对外源性药物代谢的影响。【方法】将双峰驼禁食过 夜 12 h，颈静脉放血处死后，立即于肝门静脉处采集块状肝脏组织，洗去血污称重匀浆后，采用 Ca2+沉淀 法制备双峰驼肝微粒体，并通过 BCA 法测定其蛋白含量。同时优化双峰驼肝微粒孵育体系，取不同浓度的 双峰驼肝微粒体蛋白悬液（0.016、0.031、0.063、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg·mL-1 ）、不同 浓度的探针药物咪达唑仑（MDZ）（7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000 µg·mL-1 ）分 别加入到孵育体系中，37℃预孵育 5 min 后，加入 NADPH 溶液后再孵育不同时间（0、2、5、10、15、20、 25、30 min）。待反应完全后加入冰冷的甲醇和地西泮（DZP）溶液，涡旋混匀，800 µL 全部混合液体经 14 500 r/min 离心 20 min 后，取 20 µL 上清液进行高效液相色谱紫外检测（HPLC-UV），确定最适底物浓 度、最适酶浓度以及最适孵育时间。分别取浓度为 7.813、15.625、31.250、62.500、125、250、500、1 000 µg·mL-1 MDZ 探针药物溶液 20 µL 与双峰驼肝微粒体共同孵育 15 min 后，以混有内标 DZP 的冰冷甲醇终止 反应，采用高效液相色谱紫外检测法测定反应产物 1-羟基咪达唑仑（1-OHMDZ）的动态含量，计算出部 分药物动力学参数。色谱条件：Sigma-Aldrich/Supelco Discovery C18 色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流动相为 V（乙腈） ﹕V（0.01 mol·L-1 PBS 缓冲液）= 40 ﹕60；等浓度洗脱 20 min；检测波长为 254 nm； 流速为 0.8 mL·min-1 2+ ；柱温为 30℃；进样量为 20 μL。【结果】使用 Ca沉淀法制备的双峰驼肝微粒体保持了 酶的良好活性，能满足后续体外药物代谢试验的基本要求，经 BCA 法测定其蛋白含量为(1.936±0.052) mg·mL-1 。 双峰驼肝微粒体蛋白悬液、探针药物 MDZ、PBS 缓冲液、MgCl2 溶液以及 NADPH 溶液构成双峰驼肝微粒体孵 育体系，随着孵育时间的延长，酶和底物进一步反应，当 MDZ 浓度为 125 µg·mL-1 -1 （终浓度为 7.073 nmol·mL ）， 肝微粒体浓度为 2.000 mg·mL-1 -1