氟喹诺酮类药物多残留酶联免疫检测方法的建立.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(23):4726-4735 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.23.017 氟喹诺酮类药物多残留酶联免疫检测方法的建立 1,2 2 1 2 2 1 1 2 李新朋 ，姜金庆 ，钱爱东 ，王自良 ，范国英 ，单晓峰 ，康元环 ，李 艺 1 2 （吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118 ； 河南科技学院动物科学学院，河南新乡 453003 ） 摘要：【目的】氟喹诺酮类药物（FQs）在畜牧业中广泛用于预防和治疗细菌性疾病，不合理使用导致在动物 性食品中残留，严重危害消费者健康，其检测受到世界各国重视。制备抗多种FQs 单克隆抗体（mAbs），建立间接 竞争 ELISA（icELISA）检测方法，为动物性食品中 FQs 多残留检测奠定基础。【方法】环丙沙星（CPFX）羧基上 引入氨基丁酸后为半抗原（CPFX-A），质谱鉴定；分别用碳二亚胺法（DDC）和混合酸干法将半抗原与牛血清白蛋 白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联合成免疫原（CPFX-A-BSA）和包被原（CPFX-A-OVA），紫外和红外光谱鉴定是否 偶联成功；CPFX-A-BSA 免疫 Balb/c 小鼠，间接 ELISA 和 icELISA 方法测定多抗血清效价和敏感性，选取抗血清 效价高和敏感性好的鼠用于细胞融合；NS0 细胞和脾细胞按 1 ﹕5 比例在 PEG-1500 作用下融合，筛选抗 FQs 杂交 瘤细胞株，并进行效价、亚型、敏感性和交叉反应率鉴定；体内诱生腹水法制备 mAb，液体石蜡作为诱导剂，每 只鼠注射108 个杂交瘤细胞；选敏感性和广谱特异性好的腹水mAb，建立icELISA标准曲线，对icELISA检测方法 优化，在鸡肉中添加 10 种 FQs 进行测定，将测定结果与 HPLC 法比较，用 SPSS 17.0 软件进行显著差异性分析。 【结果】半抗原改造和人工抗原合成成功；3 只鼠血清效价均达到 1﹕1.28×104 以上，2 号鼠血清效价最高（1 ﹕ 4 -1 2.56×10 ），且IC 值最低（12.92 ng·mL ），选择2号鼠作为细胞融合用鼠；4次亚克隆筛选并鉴定后获得3株敏 50 感广谱特异的杂交瘤细胞，分别命名为 2H5、3D11、4F4，细胞上清效价分别为 1 ﹕1 600、1 ﹕1 600 和 1 ﹕800， 6 5 5 -1 腹水效价分别为1 ﹕1.6×10 、1 ﹕8.2×10 和1 ﹕8.2×10 ；icELISA方法的包被原浓度为1 μg·mL ，5%猪阴性血 清4℃包被过夜，单抗1 ﹕40 000稀释，山羊抗鼠酶标二抗（GaMIgG-HRP） 1 ﹕8 000稀释；反应温度均为37℃， 标准品与单抗同时加入反应15 min，洗板后加二抗反应25 min；显色10 min，2H5细胞株腹水敏感性和广谱特异 2 性最好，2H5的线性回归方程为y=-28.022x+56.219，R =0.9 782，对10种 FQs的IC 值分别为环丙沙星（CPFX）