利用PCR-RFLP方法鉴别黄曲霉毒素产毒菌株.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(18):3675-3683 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.18.015 利用PCR-RFLP方法鉴别黄曲霉毒素产毒菌株 孙长坡，常晓娇，伍松陵，沈 晗 （国家粮食局科学研究院，北京 100037 ） 摘要：【目的】开发一种精准度高、灵敏性好、简便快捷的鉴别黄曲霉毒素产毒菌株的方法，为粮食储藏中 黄曲霉毒素污染提供早期预警，为食品工业的质量安全控制提供技术保障，为黄曲霉毒素污染的生物防治提供无 毒微生物来源。【方法】利用生物信息学方法分别以黄曲霉（ Aspergillus flavus ）、寄生曲霉（Aspergillus parasitieus ）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、酱油曲霉（Aspergillus sojae ）的黄曲霉毒素合成基因簇中的 关键调控基因 aflR 及其启动子序列为研究对象，采用 PCR-RFLP 方法对黄曲霉毒素可能产生菌株进行鉴别分析研 究；为进一步验证 PCR-RFLP 方法对产毒菌株区分结果，利用大豆培养基对上述菌株进行发酵培养，并利用 HPLC 方法测定了菌株产毒能力。【结果】生物信息学分析结果表明黄曲霉毒素可能产生菌株的aflR 高度同源, 但启 动子和结构基因的部分碱基出现了规律性变异，并导致了限制性酶切图谱中的 Nhe Ⅰ、Pvu Ⅱ和HincⅡ等限制性 酶切位点的改变；通过提取各菌株基因组 DNA，PCR 扩增得到 aflR 和启动子序列片段，测序得知片段长度分别 为 798 bp和 515bp；PCR-RFLP鉴定结果表明产生黄曲霉毒素菌株的 aflR 启动子片段经 Nhe Ⅰ酶切后得到 176 bp 和 339 bp 2 个片段，不产毒菌株无该限制性酶切位点；试验进一步对黄曲霉菌和寄生曲霉菌 aflR 结构基因 的分析发现，利用 HincⅡ分别处理黄曲霉和寄生曲霉的 aflR 的结构基因，可以分别得到 3 个片段（387、250 和 161 bp）和 2 个片段（548、250 bp）；利用 Pvu Ⅱ分别处理黄曲霉和寄生曲霉的aflR 结构基因，可以分别 得到 2 个片段（652、146 bp）和 3 个片段（413、239 和 146 bp）；产毒试验表明，米曲霉菌和酱油曲霉菌不 产生黄曲霉毒素，PCR-RFLP 分析表明不产毒的黄曲霉菌的确丧失了产生黄曲霉毒素的能力；产生黄曲霉毒素 各曲霉菌株之间产毒能力差异显著，不但产生的黄曲霉毒素总量高低相差几十倍，其产生的黄曲霉毒素组分 也不尽相同。【结论】本研究阐明了在可能产生黄曲霉毒素关键基因aflR 序列中存在的差异，通过 PCR-RFLP 方法快速鉴别黄曲霉菌株产毒与否，并且对黄曲霉和寄生曲霉两种曲霉进行了区分。黄曲霉毒素产生菌株鉴 定方法的开发，将为粮油食品安全检测和质量控制，粮食食品生产过程的质量安全控制与监测提供基于分子 水平的新型技术。 关键词：黄曲霉毒素；aflR 基因；PCR-RFLP；产毒菌株鉴别 Identification of Aflatoxin Producing Strains by Using PCR-RFLP Method SUN Chang-po, CHANG Xiao-jiao, WU Song-ling, SHEN Han (Academy of State Administration of Grain, Beijing 100037) Abstract: 【Objective 】The objective of this study is to develop an identification method of aflatoxin-producing str