hpv16 ec与人β防御素2融合基因表达质粒的构建、表达与免疫功能实验研究.pdfVIP

摘要 IIIIIII IIIII 111[11IIIIIIIIIIl 摘要 Y2524559 目的： 构建能在真核细胞中稳定表达HBD2一E7c融合基因的重组质粒，并初步研究 其在BALB／c成年雌性小鼠中的免疫功能状态及细胞免疫应答，为HBD2一E7c联 合基因疫苗的研究及应用奠定基础。 方法： 经双酶切后连接到pcDNA 双酶切与DNA序列测定进行鉴定。 2．委托北京英茂盛业生物科技有限公司构建pEGFP．C1／HBD2，并对其进行 鉴定。 I和EcoR 3．同时用Apa 入感受态细胞大肠杆菌JMl09中，随机挑选阳性克隆株，用酶切鉴定和DNA序 列测定方法鉴定联合质粒；以脂质体转染法将联合质粒瞬时转染MCF7细胞中， 荧光显微镜下观察融合基因的蛋白表达表达。 (A组)，pcDNA3．1(+)／E7c质粒(B组)，空质粒pEGFP-C 头肌肌内注射，时间间隔2周、共注射3次。 5．于末次免疫后1周用摘眼球采血法收集小鼠血清，剖杀小鼠后取小鼠脾 脏称重，采用脾脏指数测定检测脾脏变化，收集免疫小鼠脾淋巴细胞，采用FCM 方式检测淋巴细胞亚群CD4+、CD8+细胞数量及比值；以上海科肽生物科技有 AlaGluPro AlaHis AsnIleValThr Arg Tyr 限公司合成的HPVl6E7短肽(GinAsp Phe CysCysLysCysAsp)为抗原，经摸索优化条件后用间接ELISA检测小鼠E7 抗体产生情况。分析小鼠免疫功能，评价联合质粒的免疫效果。 结果： 摘要 联合质粒，基因序列与设计序列一致、基因位点无突变与表达框架移位。转染 达。 pcDNA3．I(+)／E7c升高。 3．脾脏指数显示融合基因组即D组、B组、C组三组的脏器指数明显低于 pcDNA3．1(+)／E7c质粒(B组)，提示脾脏有一定萎缩。 4．经流式分析仪分析发现，pEGFP．C (FITC)阳性淋巴细胞数与其余三组差异有统计学意义(P0．05)，占脾淋巴细 胞总数的42．52±4．42％，绝对计数为4190±144／10 000个细胞，明显高于其余 3830+138，3910+138和3 100+133每10000个脾淋巴细胞。 100±133／10 000个细胞，与其余三组相比显著降低，且差异有统计学意义(PO．05)，其中 000个 8304-138／10 000以 细胞明显高于pcDNA3．1(+)／ETc(B组)的39．4±3．78％和3 910±138／10 000，但三者之间差异无统计学意义(P0．05)。 三组相比，差异有统计学意义(户0．05)，占脾淋巴细胞总数的50．164-4％，绝 9704-140／10 对计数为4 000个细胞，明显高于其余三组(P0．05)：且 于PBS对照组(P0．05)，它们对应的绝对细胞计数分别为4120±127，3780 ±114和2300±133每10000个脾淋巴细胞。 摘要 (C组)的1．01±0