nurrl和bn4基因转染促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究.pdf

Nurrl和Brn4基因转染促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究 中文摘要 中文摘要 第一部分Nurrl和Bm4基因转染对神经干细胞 向多巴胺能神经元分化的影响 目 的： 观察体外Nurrl和Bm4基因转染对大鼠中脑神经干细胞向多巴胺能神经元分 化和成熟的影响。 方法： 定等步骤构建pEGFP—N1一Nurrl和pDsRed-N1．Bm4真核表达载体。 2．采用无血清培养技术从孕14天胎鼠的中脑组织中分离培养神经干细胞，用 Nestin和BrdU标记及免疫荧光检测验证其胚胎源性和分裂增殖能力，分别用神经 光细胞化学检测验证其多分化潜能。 blot和实时PCR等方法检测 光蛋白报告基因的表达评价转染效率，应用Western 记技术检测神经干细胞分化为多巴胺能神经元的情况，并测量TH阳性细胞的胞体 面积和细胞周长，用高效液相色谱仪检测细胞分化培养液中多巴胺的释放水平。 结果： 1．从大鼠脑组织中克隆到Nurrl与Bin4基因的全长序列，经基因重组后获得 pEGFP-N1一Nurrl和pDsRed-N1一Bm4真核表达载体。 中文摘要 Nurrl和Brn4基因转染促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究 2．胎鼠中脑细胞悬液培养1周后可形成由数百个细胞组成的呈悬浮生长的神 数量最多，神经元次之，少突胶质细胞最少。 干细胞6．8小时后即可见荧光蛋白表达，转染后48小时表达最明显，随后荧光逐 渐减弱减少，至3周左右基本消失。荧光照片经图像分析得出基因转染效率为35％ 左右，两种质粒共转染没有竞争性抑制作用。 4．Western blot和实时定量PCR结果分析显示，重组质粒转染后目的基因的表 Bin4的表达没有叠加效果。 ． 5．免疫荧光检测结果显示，对照组和Bin4组中TH阳性神经元很少，分化率 约为3％，细胞形态不成熟，表现为TH多集中在胞体内表达，细胞胞体较小，突 分化率为16．5％，但细胞形态也欠成熟，细胞突起很少。TH阳性神经元也很少共 成熟，TH在胞体和突起中均有表达，细胞胞体较大，突起细长丰富，局部交织成 网状。TH阳性神经元大多数能共表达DAT。 6．高效液相色谱分析显示，对照组和Bin4组的培养液中多巴胺含量很低，Nurrl 组多巴胺含量略有升高，Nurrl+Bm4组多巴胺含量最高，达到3．40 lag／ml。 结论： 1．从鼠胚中脑组织中分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新能力，并具有分 化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能，是中枢神经系统的干 细胞。 2．Nurrl基因过表达能促进神经干细胞向TH免疫阳性的多巴胺能神经元分 化，但产生的细胞欠成熟；Bin4基因不能诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化， 但Nurrl联合Bm4基因共转染能促进神经干细胞向形态、表型、功能成熟的多巴 胺能神经元分化。 ll Nurrl和Brn4基因转染促进神经干细胞向多巴胺能神经元分化的研究 中文摘要 第二部分转基因神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究 目 的： 观察转基因的神经干细胞移植入帕金森病(PD)大鼠模型损毁侧纹状体后存 活、分化和发挥生理功能的情况。 方法： 1．应用脑立体定位技术单点注射6．羟基多巴胺(6．OHDA)至大鼠右侧前脑内侧 束制备单侧PD大鼠模型。然后应用阿朴吗啡(APO)诱发旋转试验验证模型是否成 功，并行脑组织切片Nissl染色和TH免疫组织化学染色验证模型的可靠性。 2．将成功PD大鼠模型随机分为4组进行移植，假手术组不移植神经干细胞； 细胞。各组神经干细胞用DIL标记后在脑立体定位下进行移植。用APO腹腔注射 诱发旋转试验观察移植后大鼠行为的改善情况。移植后12周脑组织切片行TH免 疫荧光检测移植细胞分化为多