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丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠海马APP表达的影响 硕士研究生 王兴萍 导 师 芦宏 郑州大学第一附属医院神经内科 河南郑州450052 摘要 背景和目的：慢性脑缺血是神经系统的一种常见的病理状态，伴发于血管性痴呆 (Vasculardementia，VD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)及 Binswanger病等多种疾病的病理过程中，早期以认知功能损害为主要表现，最终 导致持久或进展性认知与神经功能障碍，因此研究其发病机制对慢性脑缺血的临 床防治具有普遍意义。慢性脑缺血的病理基础之一是大脑皮层及其它脑区出现大 一般由42(39～43)个氨基酸残基组成，分子量约为42kDa，由B一淀粉样前体蛋白 (8一amyloidprecursorprotein，APP)水解产生，APP是一个很大的蛋白质分 菜籽中提取出来的左旋体，后经人工合成为消旋体，经中国医学科学院药物研究 所的科研人员20余年的研究证明，丁基苯酞对动物急性缺血性卒中具有多种机 制的治疗作用，但是该药用于慢性脑缺血是否有效有待研究。海马是脑缺血最为 敏感的部位，且位置特殊，与认知等有密切关系，海马CAl区与海马内部及海马 外结构有广泛的纤维联络，是长时程增强(10ng-term 成及学习、记忆的重要部位，因此选择了大鼠海马区作为研究对象。已有免疫组 织化学研究发现，丁基苯酞可抑制皮层和海马的神经元变性、坏死，同时可减轻 星形胶质细胞增生，活化，以及抑制少突胶质细胞减少，并能改善慢性脑缺血引 起的认知功能障碍。有关丁基苯酞治疗慢性脑缺血对AB表达影响的研究目前国 内外尚未见报道。本文旨在运用免疫组织化学法、RT—PCR法及免疫斑点法观测 mRNA及蛋白水平的表达变化， 应用该药物干预后慢性脑缺血老龄大鼠海马区APP 进一步研究该药对慢性脑缺血干预作用的治疗机制，探讨该药在细胞学、分子生 物学及蛋白水平的作用机制，可以让临床医生更准确地理解和把握该药的作用机 制和临床适应症，为该药治疗慢性脑缺血提供理论依据。 材料和方法： 1．动物分组与模型制备： 试验动物选用健康Wistar大鼠150只(郑州大学实验动物中心提供)，雌雄不拘， 低剂量组(D)和高剂量组(E)，共5组，每组30只。假手术组仅暴露双侧颈总动脉 而不结扎，余各组采用双侧颈总动脉结扎(2Vo)法制备动物模型。c组先给予丁基 苯酞80ng．Kg-1．d一，1月后停药，行2VO术；B组正常饲养2月后仅给予安慰剂；A、 D、E组行2VO术，正常饲养2月后，A组给予安慰剂，D组给予丁基苯酞60mg．Kg～．d～，E 组给予丁基苯酞120mg．Kg一．d一．连续灌胃1个月：共3fl后处死动物。 2．标本采集： ①免疫组织化学法标本采集：麻醉动物，37‘C生理盐水灌洗后断头迅速取出脑组 织，放入4％多聚甲醛中后4C冰箱内固定24d,时，经梯度酒精脱水，二甲苯透明， 石蜡包埋，制作脑部冠状石蜡切片(厚度3um)，以备免疫组化染色。 ②RT—PeR及免疫斑点法标本采集：麻醉动物，断头取血后迅速冰上分离脑组织， 装入1．5mlEP管中，一80℃保存，以备RT—PCR及免疫斑点实验使用。 3．免疫组织化学法 ①抗体：一抗兔抗APP单克隆抗体 二抗HRP标记山羊抗兔多克隆抗体 ②免疫组织化学染色步骤：烘片、脱蜡至水、抗原修复、血清封闭、加一抗、加 二抗、DAB显色、苏木素复染、分化、封片、照相； ⑨图像分析 4．嗣卜PCR： ①组织总RNA提取：超低温冰箱取标本，迅速冰上分离，取出其中一侧海马，用 和含量。 ②逆转录一聚合酶链反应： 木 3’ 弓I物B—Actin：5’GGGA从TCGTGCGTGACAT 5’ TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’ 7 APP：5 GGGTCTGGGTTGACAAACATC3’ 7 5 CATTCTGCTGCA代T