中国hivais患者外周血单个核细胞apobec3g表达水平及病毒vif变异与疾病进展的相关性研究.pdf

·中文论著摘要· 表达水平及病毒Vif变异与疾病进展的相关性研究 目 的 机体天然免疫系统在抵御HIV感染中发挥重要作用，APOBEC3G B 3G)是新发 (ApolipoproteinmRNA·editingEnzyme，CatalyticPolypeptide-like 现的细胞内天然免疫因子，具有抑制HIVVif缺失病毒(HⅣ△vif)复制的能力。 Vif(VnionFactor)是HIV-1病毒的调节蛋白之一，以细胞依赖方式在 Infectivity 新生病毒的组装、释放或者成熟阶段增加其感染性。体外实验显示，APOBEC3G 通过诱导HIVAvif病毒逆转录过程中生成的eDNA，将胞嘧啶脱氨基转变为尿嘧 啶，诱导病毒基因组DNA的致死性突变而抑制病毒复制。但当病毒Vif蛋白存在 时，可通过阻止APOBEC3G组装入病毒颗粒以及诱导泛素化降解等途径来拮抗 显减弱或完全丧失。 目前，APOBEC3G在HIV感染者体内的表达水平、作用及与疾病进展的关系 研究尚未见报道。我国HIV感染者的遗传背景、免疫特性、感染病毒亚型和主要 究。因此，本课题首次对中国不同疾病进展阶段的HIV／AIDS患者外周血单个核 然免疫因子，为HIV的疫苗设计及治疗提供有价值的理论依据。 方法 1、研究对象 由河南省疾病预防与控制中心以及中国医科大学艾滋病研究所艾滋病确认实 验室经Westernblot试验确认为阳性，未经抗病毒治疗的HIV／AIDS患者。调查与 采血前征得患者同意，并签订知情同意协议。患者血浆标本病毒核酸经套式聚合 染时间和CD4+T细胞数量分为缓慢进展组(SlowProgressor，SP)：感染时间 合并艾滋病指征性疾病。HIV抗体阴性健康对照来自河南省。 2、CD4+T淋巴细胞计数 应用美国BECTON CD4+、CD8+、CD3+T淋巴细胞绝对值。将20山CD4／CD8／CD3TRITEST试剂加 室温避光15min，FACSMULTISET软件检测并进行自动分析。 3、病毒载量测定 Monitor1．5commercial kit在COBAS 定病毒载量。HIV病毒载量经lOglo对数转化后用于统计分析。 4、标准品质粒的构建 RNeasy Reverse Transcription 到DH5a感受态菌中，蓝白筛选后获得阳性克隆，测序验证，纯化重组质粒，紫 外分光光度计定量后根据分子量换算为分子拷贝数，10倍系列稀释质粒制备质粒 2 标准品。 5、实时定量PCR检测APOBEC3GmRNA水平 取健康对照和HIV感染者EDTA抗凝全血10“，常规提取外周血PBMC。 mini 采用Qiagen公司的RNeasy ImProm．iiTMReverse TranscriptionSysterm和随机引物逆转录合成eDNA。 APOBEC3G(NM021822)和内参GAPDH(NM002046．3)特异性探针序列为 X PCRMasterMix1 X 25p．1实时PCR反应体系：2 2．5m，20 TaqMan@Universal Gene TaqManExpressionAssay 2 10 15S、 用ABI mill，950C 7500实时PCR仪进行检测，反应条件500C m吐950C 600C1 rain 40循环。APOBEC3G和GAPDHmRNA绝对拷贝数由系列稀释的质 粒构建的标准曲线获得，每份标本设2个