血小板裂解液复脂肪来源干细胞促进腱骨愈合的实验研究.pdf

血小板裂解液复合脂肪来源干细胞促进腱骨愈合的实验研究 中文摘要 血小板裂解液复合脂肪来源干细胞促进腱骨愈合的实验 研究 中文摘要 第一部分 血小板裂解液对无血清培养基中脂肪来源干细胞增殖的影响 目的：研究血小板裂解液替代胎牛血清对脂肪来源干细胞（ADSC ）分离、增殖、 免疫表型的影响，为临床个体化应用 PL 进行损伤修复提供实验依据。 方法：根据二次离心法制作血小板血浆（PRP ），然后通过冻融法制作血小板裂 解液（PL ）。进行ADSC 的分离、培养，测定其免疫表型，使用CCK-8 法测定 10%PL 组培养、5%PL 组培养、10%FBS 组培养对细胞增殖活性的影响。 结果：对大鼠血液的二次离心法可以制备出六倍于基础血小板浓度的PRP ，在对 大鼠 ADSC 进行培养时，其免疫表型没有发生突变，CCK-8 结论为 10%PL 在培养 4 天时 ADSC 增殖活性显著高于 10%FBS， 结论：PL 用于培养 ADSC 时安全性好，可以在无血清培养基中应用；10%PL 培 养 ADSC 时，具有显著促进增殖的优点，而 ADSC 的免疫表型没有因为PL 的存在而 发现突变。 关键词：富血小板血浆，血小板裂解液，脂肪来源干细胞，无血清培养基 第二部分 血小板裂解液对脂肪来源干细胞迁移及成软骨分化的影响 目的：评估血小板裂解液对ADSC 迁移的影响，验证 PL 在体外对 ADSC 的募集 作用。研究 PL 在 ADSC 成软骨分化时的作用，为将来体内应用 ADSC 促进腱骨愈合 提供实验室依据。 方法：使用Transwell 法对各种浓度的 PL 进行迁移实验，10%FBS 作为对照组， I   中文摘要 血小板裂解液复合脂肪来源干细胞促进腱骨愈合的实验研究 然后分三组：空白对照组，TGFB3 组，PL+TGFB3 组分别进行 ADSC 的成软骨诱导 培养。使用阿里新蓝染色测定检测细胞分泌的蛋白聚糖含量，同时行 II 型胶原免疫 荧光检测确定其表达，在各个时间段行 qPCR 检测 II 型胶原 mRNA 表达，在 4w 时 行 OCN 的mRNA 表达。 结果：在 48h 后，可见各浓度 PL 组有数量不一的 ADSC 附着与 Transwell 纤维 膜，5%PL 组细胞迁移能力显著大于其它各组。成软骨诱导后阿里新蓝染色见 PL+TGFB3 组和 TGFB3 组均匀蓝染，II 型胶原免疫组化提示 2w 及 3w 时对照组无染 色，而 TGFB3 组在 2w 及 3w 时均有 II 型胶原染色，PL+TGFB3 组在 2w 和 3w 时染 色丰富。qPCR 检测提示对照组与 TGFB3 或者 TGFB3+5%PL 相比，mRNA 表达量要 小，2w ，3w，4w 的P 值小于 0.001 ，有统计学差异。TGFB 诱导与 TGFB3+5%PL 诱 导，2w 时 P0.05 ，3w 时 P0.001 ，4w 时 P0.01 ，均有统计学差异，后者mRNA 表 达量大于 TGFB3 诱导组。OCN 的mRNA 无统计学差异。 结论：PL 对 ADSC 的促进迁移作用有浓度依赖，5%PL 对 ADSC 具有较强的促 迁移作用，特定环境下能促进软骨定向分化，其作用优于单纯使用 TGFB3 ，且不会 发生成骨分化。 关键词：血小板裂解液，脂肪来源干细胞，成软骨分化，qPCR 第三部分 血小板裂解液复合脂肪来源干细胞对大鼠跟腱腱骨愈合界面的影响 目的：探讨 5%PL 复合 ADSC 对腱骨结合处的愈合影响，观察其是否能促进纤 维软骨形成，从而从组织学以及生物力学方面改善腱骨愈合质量。 方法：建立大鼠跟腱腱骨愈合模型，清理跟腱止点后分三组，假手术组（G1 ）， ADSC