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RNA干扰技术调控青光眼术区纤维化的研究 摘要 RNA干扰技术调控青光眼术区纤维化的研究 中山大学中山眼科中心 专 业： 眼科学 博士研究生： 黄圣松 导 师： 葛坚教授 摘 要 目 的 青光眼是以病理性高眼压、进行性视神经变性和视野缺损为特征的，位列全 球第二位不可逆性致盲眼病。目前青光眼滤过性手术是治疗青光眼的最主要手段 之…，手术失败的最主要原因为滤过道的疤痕化，随着一些抗代谢药物如5一Fu、 MMC等的应用，抗青光眼滤过手术的成功率已大大提高，但随之带来一些不可避 免的并发症：滤过泡渗漏、低眼压、眼球感染、低压性眼病等等，严重影响了滤 过性手术的效果，并进一步加重视功能损害。因此，寻找新的调控术区疤痕化同 时又不影响创口愈合的平衡调控方法是抗青光眼滤过性手术成功的关键。 本研究探讨应用RNA干扰技术，特异性地抑制IKKB的表达，从而下调NF— K B的活性，降低细胞因子、生长因子的分泌，平衡调控青光眼术区创口愈合， 提高手术的成功率的可行性、安全性、有效性及其作用机制。 方 法 1、正常人眼球筋膜成纤维细胞的体外培养和鉴定：取正常供体新鲜的Tenon’s 囊组织，利用组织块培养法，进行成纤维细胞体外培养，并利用光镜、电镜、细 胞免疫组织化学法鉴定人成纤维细胞； RNA干扰技术调控青光眼术区纤维化的研究 摘要 2、设计、合成靶向IKKB基因的siRNAs，并进行筛选得到具有高效干扰效 率的siRNA； Transfection 3、利用高效的转染试剂HiperFect Reagent将siRNA转入体外培 nM、 nM、25nM、50 养的人成纤维细胞，并设有不同的转染浓度(5nM、10 100nM、200nM)进行RNA干扰，同时设有空白埘照组、阴性对照组，然后用 RT-PCR的方法检测干扰后IKKB的mRNA表达水平；用Westernblot的方法检测 IKKB的蛋白表达水平；用MTT法检测RNA干扰后成纤维细胞增殖能力受到的 影响，绘制其量效曲线；采用划痕法检测成纤维细胞的迁移能力； 4、采用激光共聚焦荧光显微镜检测RNA干扰后NF．KB的活性，并采用 MMP．9，探讨其抑制成纤维细胞增殖的可能机制； 5、利用灵长类动物恒河猴制作青光眼滤过性手术模型，并在手术同时进行 siRNA体内转染术区筋膜组织，进行动物体内的RNA干扰治疗，同时设有MMC 测量，并于术后28d、42d时取标本进行术区组织病理学切片、Massion三色染色、 天狼星红染色偏振光检测术后各组的胶原组织增殖情况。 结 果 1、体外成功培养正常人眼球筋膜成纤维细胞，细胞呈长梭形，胞浆丰富，核 大，生长能力强，呈旋涡样或羽毛样生长，Vimentin染色阳性； 2、设计合成的siRNA经筛选获得1条较为高效的siRNA；体外培养的成纤 抑制水平随着转染浓度的增大而增大，Westernblot的结果也况明IKKB的蛋白表 达也受到了抑制，也具有浓度依赖性。 3、MTT法结果示：靶向RNA干扰抑制IKKB的表达后，体外培养的成纤维 nM、25nM、50nM、100nM、 细胞的增殖受到限制，转染浓度为5nM、10 200 法检测也显示成纤维细胞的迁移能力受到了抑制；