rna干扰对w1基因表达的抑制作用.pdf

RNA干扰对wTl基因表达的抑制作用 中文摘要 中文摘要 目的研究silLNA(small interferingRNA，siRNA)对wTl基因的抑制作用，构 建wTl基因siI州A载体，为进一步探讨wTl在白血病中的生物学功能及白血病 的基因治疗奠定基础。 方法 RNA， 设计制备多对针对WTl基因的小干扰RNA(smallinterfering 2000转染乳腺癌细胞株MCF一7细胞， siRNA)，通过阳离子脂质体Lipofectamine QuantitativePolymerase 流式细胞仪检测转染效率，采用实时定量PCR(Real．time Chain mRNA的表达，筛选出最有效 Reaction，RQ．PCR)法测定WTl及内参B．actin 的siRNA，Western 胞进行检测分析，观察RNAi效应的持续时间。并用流式细胞仪(FCM)检测WTl 被干扰后，MCF一7细胞对长春新碱诱导凋亡的敏感性。根据最有效的siRNA序 hair 列，设计合成两条shRNA(small 两端分别设计不同的两个限制酶切位点。退火形成siRNA载体插入片断。用限制 性内切酶将siRNA空载体线性化，T4连接酶将插入片断插入siRNA空质粒中。经 酶切、PCR和测序的方法鉴定质粒是否成功。通过脂质体将装有、ⅣT1的干扰质粒 和阴性对照质粒转入K562细胞中，以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因，用 流式细胞仪和荧光显微镜观察转染效率和G418筛选4周后质粒表达效率。RT-PCR 检测wTl基因表达变化，采用台盼兰拒染法、MTT比色法、甲基纤维素集落形成 实验检测WTl基因干扰后对K562细胞生长的影响。通过流式细胞仪测定 AnnexinV结合力观察WTl基因干扰后对K562细胞诱导凋亡的作用。 V结合力的方法观察wTl基因被干扰后对长春新碱的诱导凋亡作用的敏感性，对 RNA干扰对wTl基因表达的抑制作用 中文摘要 3．8％，而干扰组凋亡率达34．1％、45．7％和32．3％。 照组凋亡率仅为4．7％、5．3roan ④经酶切、PCR及测序鉴定确定质粒构建成功。⑤用台盼兰拒染法绘制细胞生长 104， 胞在各个时间段的A值均低于对照组，统计学处理有显著性差异，p0．0001。甲 基纤维素集落形成实验中，K562／pWTls所形成绝大多为集簇，集落鲜有形成，单 集簇数也明显降低。⑥MTT实验显示， 11 的IC50值分别为182．2、188．4和105．4 组升高。 2000在转染中表现出稳定、高效和低毒的特点。 结论Lipofectamine WTlsiRNA能有效抑制、ⅣTl基因的表达，其浓度与效应并不呈一定的剂量效应关 系，随着siRNA浓度加大，干扰效率反而呈现降低的趋势。乳腺癌MCF一7细胞 株转染了wTlsiRNA后，与对照相比，对长春新碱诱导的凋亡作用变得敏感。成 功构建了wTl干扰质粒，转入干扰质粒后，K562细胞的增殖率降低，凋亡率提 高。提示wTl基因可以作为实体瘤和白血病基因治疗的靶点，然而，将siRNA安 全的导入人类细胞仍然是一个有待解决的重要问题。 关键词：wTl：siRNA；RNAi；实时定量；MCF一7细胞 K562细胞；基因治疗 作 者：谷敏