以β-淀粉样蛋为靶的单价及二价真核表达载体的构建和表达.pdf

王烈峰项士论文 以B一淀粉样蛋白为靶的单价及二价真核表达载体 的构建和表达 学科专业： 人体解剖与组织胚胎学 硕士生： 王烈蜂 导 师： 姚志彬教授 摘 要 Disease， B一淀粉样蛋白(A1342)异常聚集和沉积是老年性痴呆(Alzheimer’S AD)的主要病理改变“一，1999年Schenk．D发现以A1342为抗原接种AD转基因 模型鼠可产生抗AB也抗体，可以清除或减少鼠脑A1342的异常聚集和沉积，鼠血、 脑AB水平明显下降”1。进～步临床试验因部分受试者出现脑脊髓膜炎症状而被 1．42、 迫中止“3。为寻找更安全、有效、廉价的治疗方案，本室构建了pcDNA3．1一AB 1342主动免疫清除老年斑的作用 B42。2真核表达质粒，为进一步研究A pcDNA3．1．A 机理和DNA疫苗的研制奠定基础。 一、T92576转基因鼠基因组DNA的提取和目的基因扩增 饱和酚／氯仿法鼠尾提取T92576转基因鼠基因组DNA，根据其基因序列， 设计出扩增编码A13基因的引物，以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因片 层}AB 42．1、AB42-2。 l-42、AB B B42x2的构建及鉴定 二、真核表达载体pcDNA3．1．Al-42．pcDNA3．1．A 将目的基因片段AB1_42纯化后与质粒peDNA3．1分别用限制性内切酶 I、XhoI酶切、纯化后用T4DNA连接酶将目的基因片段定向克隆至质粒 Kpn 王燕峰磺士论支 1-42，将目的基因片段 pcDNA3．1的多克隆位点间，得到藏组质粒pcDNA3．卜AB l瓣切、 A§啦-|缝纯嚣与囊粒peDNA3。1分裂薅嚣耪隈剁拣内切酶K秽l、BamH 纯化艏用T4DNA连按酶将目的基阂片段AB 42，l定向克隆至质粒pcDNA3．1的多 B 1342-2纯化后 42-1稀将目的基因片段A 克隆位点问，得到重缀质粒pcDNA3+l-A l懿甥、 l、Xho 与重缀激粒pcDNA3，l诅15鸵。1分嬲躅薅秘限铡蠛痰镪酶BamH 842．t 纯化后阁T4DNA连横酶将目的基阙片段定向究豫至重组质糙pcDNA3．1-A B艄咖将重组碰粒转化大肠杆菌 的多克隧位点间，得到重组质粒peDNA3．1．A DH5《，分裂爱稳应戆双薅酶翡及溅穿涯实该黧缍矮蕴稳建残功。 13 1342x2的真核表达 l船pcDNA3．1-A 三、peDNA3．1。A