人胃癌细胞系端酶逆转录酶基因启动子区域甲基化的检测.pdfVIP

人胃癌细胞系端粒酶逆转录酶基因启动子 区域甲基化的检测 硕士研究生 王亚东 指导教师 张锦瑜教授 指导小组 姜志良教授 尹家俊 副教授 专业名称 外科学 摘 要 目的：胃癌是严重影响人类健康的、常见的恶性肿瘤其病因迄今 尚未完全明了，治疗效果仍很不理想，人端粒酶逆转录酶(hTERT)作 为端粒酶的限速酶，已成为肿瘤诊断和治疗的重要靶点但其调控极其 复杂，本课题运用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测不同分化的人胃癌 细胞系hTERT基因启动子区域甲基化情况，探讨人胃癌细胞系在该区 域是否存在甲基化，甲基化程度是否与肿瘤的恶性程度相关，以进一 步解释胃癌细胞恶变的机制，并通过对端粒酶阳性正常的人永生化细 胞及端粒酶弱阳性的正常人淋巴细胞该区域的甲基化检测，进一步探 基因治疗提供一个新的思路。 方法：取对数生长期的胃中分化腺癌细胞SGC．7901和低分化腺癌 细胞BGC．823，分别以人乳腺癌细胞MCF．7及正常人脐静脉内皮细胞 ECV-304及淋巴细胞作为阳性对照，以正常人胚肺成纤维细胞WI．38 作为阴性对照。采用改进高盐法提取不同细胞的基因组DNA，紫外分 光光度计确定核酸纯度，并定量。高纯度的基因组DNA应用野生型引 未经修饰的原始hTERT核心启动子区域部分序列，判定胃癌细胞是否 ·1· 过碱变性、硫化与脱氨、纯化与脱硫以及回收沉淀等步骤完成基因组 DNA的亚硫酸化修饰；修饰后的DNA，分别应用甲基化引物及非甲基 域甲基化情况；PCR产物分别经2％、1．5％琼脂糖电泳，溴化乙锭染色， 紫外透射反射仪上观察结果，并将纯化产物克隆后测序观察CpG位点 甲基化情况。 结果：不同分化的胃癌细胞、人乳腺癌细胞及正常人脐静脉内皮 细胞、正常人淋巴细胞及正常人胚肺成纤维细胞均检测出hTERT核心 启动子基因序列，端粒酶阳性的胃癌细胞、人乳腺癌细胞以及正常的 人脐静脉内皮细胞及端粒酶弱阳性的正常人淋巴细胞均可用甲基化引 物扩增出目的基因片段，而应用非甲基化引物则无目的基因片段。与 此相反，端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞则只能用非甲基化引物 扩增出目的基因片段，三种引物的PCR产物克隆测序结果正确，并发 现不同分化的胃癌细胞的hTERT．启动子区CpG位点甲基化情况存在差 别。 结论：不同分化的胃癌细胞hTERT基因启动子区域均存在甲基化， 且甲基化程度不同，可能与细胞的分化程度相关。本实验所检测的端 粒酶阳性的肿瘤细胞及人永生化细胞、弱阳性的淋巴细胞均存在不同 程度hTERT基因启动子区域甲基化，甲基化调控可能广泛存在于端粒 酶阳性的组织及细胞中，通过某些机制保护或促进hTERT的表达。端 粒酶阴性的正常人成纤维细胞的hTERT基因核心启动子区域不存在甲 基化，端粒酶阴性的人正常体细胞可能不是通过hTERT启动子区甲基 化抑制hTERT的表达。 关键词： 胃癌细胞 端粒酶逆转录酶 启动子DNA甲基化 DNA DetectionofthePromoterof Methylation Region theHuman TelomeraseReverse Transcriptase line Genein cancercell gastric Graduate Yadong student：Wang Director：Professor