人脂肪细胞中pc-1的表达及调控携带pgc-1和pgc-1 sirna慢病毒载体的构建与表达.pdf

内容摘要 中文摘要 第一部分 人脂肪细胞中PGc一1的表达及调控 目的：胰岛素抵抗(insulinresistance，IR)贯穿于2型糖尿病发生发展的整 个过程，是2型糖尿病发病的重要基础。而脂肪组织在胰岛素抵抗的发生中起着 重要作用，很多资料显示，肥胖与胰岛素抵抗有高度相关性。而且，脂肪组织作 为新的内分泌器官，分泌的一些激素和细胞因子与胰岛素抵抗密切相关。 过氧化物酶体增生激活受体Y协同刺激因子a(PGC．1)是近年来发现的一 种转录协同刺激因子。它被认为在适应性产热、线粒体生成、脂肪酸B氧化及肝 糖异生等过程中有着重要作用。肝脏中的PGC．1表达增加，能增加肝糖输出， 促进糖异生；肌肉组织中的PGC．1可增加GLUT4的表达，通过增强葡萄糖的转 运，降低血糖。 对于PGC．1与糖尿病的关系得研究，主要集中在肝脏和肌肉。而关于脂肪组 织的研究尚少，因此，本研究主要观察PGC．1在糖尿病人及正常人脂肪组织中 的表达，PGC一1在体外培养的脂肪细胞中的表达及其调控因素。另外，我们还构 建了PGC一1的慢病毒表达载体及PGC．1siRNA的慢病毒载体，观察转染这些构 建的慢病毒后对脂肪细胞中PGC一1下游基因的影响。 PGC一1的表达；流式细胞仪和油红染色鉴定ADSCs和分化成熟的脂肪细胞； siRNA慢病毒分别转染脂肪细胞，RT-PCR观察转染 将PGC．1』慢病毒和PGC．1 病毒后对脂肪细胞中PPAR．Y和GLUT4的影响。 结果：糖尿病人和正常人相比，皮下脂肪组织中PGC．1的表达显著升高； 1ng／ml的TNF．a刺激脂肪细胞后，随着时问的延长，PGC—l的表达增加。而 10ng／ml的TNF．a刺激脂肪细胞后，随着时问的延长，PGC一1的表达下降；毗咯 列酮处理脂肪细胞后，PGC一1的表达呈时间依赖性增加：PGC—l慢病毒转染脂肪 细胞后，PPAR—Y和GLUT一4的表达增加。PGC—lsiRNA慢病毒转染脂肪细胞后， PPAR-Y和GLUT一4的表达下降。 结论：糖尿病人外周皮下脂肪中PGC一1的表达升高：TNF．a和吡咯列酮参与 表达。 关键词：过氧化物酶体增生激活受体y协同刺激因子(PGC．1)：脂肪源性 间充质干细胞；脂肪细胞；过氧化物酶体增生激活受体Y(PPA脚)；葡萄糖转 运蛋 白4(GLUT4)；慢病毒；TNF．Ⅱ；毗咯列酮 第二部分 携带PGC-1和PGC-1siRNA慢病毒载体的构建与表达 目的：过氧化物酶体增生激活受体v协同刺激因子a(PGC一1)是近年来发现 的一种转录协同刺激因子。它在不同的细胞发挥着不同的作用。慢病毒载体因为 能够转染非分裂期细胞和分裂期细胞，携带的遗传信息能够整合到宿主的基因 组，实现目的基因长期稳定的表达而成为应用范围日益广泛的病毒载体。因此我 们构建了PGC一1慢病毒表达载体和PGC．1siRNA慢病毒载体，观察转染病毒后 对ADSCs及脂肪细胞的影响。 方法： siRNA连接到pLVTHM 将PGC．1全长克隆到pWPXL质粒，PGC．1 质粒。包装病毒后，流式细胞仪检测病毒滴度：MTT和流式细胞仪检测转染病 毒后对细胞的影响；RT-PCR检测转染病毒后PGC．1的表达。 5时， 结果：随着病毒滴度的增加，转染效率逐渐增加。病毒滴度为0．1和O 对细胞增殖有轻度刺激作用，对细胞凋亡没有影响。病毒滴度升高后，转染早期 能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。PGC—l慢病毒载体能够升高脂肪细胞中PGC．1 的表达，PGC．1siRNA慢病毒载体能够抑制脂肪细胞中PGC一1的表达 结论：慢病毒载体能够长期有效的转染ADSCs和脂肪细胞。 关键词：过氢丝物醢体增生馓恬受霄可韧带用网洇乎；一脂瞌源：幽哥充质午!田～ 力豇强鼬耙田。脆慢病毒；RNA干扰；凋亡 中图分类号：R587．1：R977．1+5