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人脐带mscs脊髓生物支架相容性的体外研究

中文摘要 人脐带MSCs与脊髓生物支架相容性的体外研究 摘 要 目的:使受损脊髓功能得到恢复依然是再生医学的难题。 细胞移植被普遍认为是最有希望治疗脊髓损伤的策略之一, 但其前景取决于移植物与脊髓断端融合,并有足够的轴突再 生并跨过脊髓建立有效地连接。为此,利用组织工程支架材 料、种子细胞等工程学技术重建脊髓的方法,是近年来研究 的热点n1。 我们先前的研究业已表明应用化学萃取的家犬脊髓神经 基膜样组织具有三维网状结构,可为人脐带间充质干细胞分 化、增殖提供良好载体。最近,我们利用这种质地柔软的脊 髓神经基膜样组织作为髓芯,外面包被用天然生物膜材料(国 旋凸梁式圆管,制成脊髓生物支架。本实验目的是对这种新 umbilicalcord 型脊髓支架与人脐带间充质干细胞(human stem mesenchymal 究, 为横贯性脊髓损伤动物模型及临床应用奠定基础。 方法:1、脊髓生物支架内髓芯的制备:切取幼犬胸段脊 箱中过夜;蒸馏水浸浴3h后放入40mM/L脱氧胆酸钠蒸馏水 溶液中,置4C冰箱12h。以上步骤重复4次。萃取后的髓芯 分为三部分:大部分经无菌试验处理后置4℃冰箱待用,部分 行电镜及冰冻切片观察,剩余部分通过真空冷冻干燥处理后 保存。 中文摘要 2、人脐带间充质干细胞培养:取足月妊娠剖宫产健康胎 儿的脐带,以PBS充分冲洗,剔除脐带动、静脉,将其余的 脐带问质组织切割成直径约1ram大小的组织块,在含有20 %的胎牛血清、2mM左旋谷氨酰氨(L-Glu)、100I7/ml青霉 代培养5—7天后,显微镜下可见大量细胞自组织块中游出, 向外呈放射状贴壁生长。待10天左右,细胞达到80%一90 %汇合后,加入0.2%胰酶消化传代。收集第三代MSCs经流 式细胞学检测细胞表面抗原证实其为脐带间充质干细胞后冻 存待用。 3、将用天然生物膜材料做成的带有脑脊液通道的螺旋凸 梁式圆管部分切开,作断面及内表面扫描电镜观察,剩余部 分圆管套在已制备好的髓芯的上,置4℃冰箱待用。 4、冻存的人脐带MSCs复苏后与脊髓生物神经支架相容 性研究:对冻存的人脐带MSCs复苏使细胞密度达到1×10 /ml,分点注入支架内,置入干细胞一支架体外培养液中培养, 扫描、透射电镜观察人脐带MSCs在不同时间点的生长发育 情况。 结果:1、经组织块原代培养约5天后,可见大量细胞自 组织块游出,于周边向外贴壁呈放射状生长,形态较均一, 呈长梭形。10天达到80%--90%汇合,镜下可见细胞胞浆丰 富,轴突伸长,多角状。消化后以1:2—1:3的比例传代细 胞,接种约30分钟后细胞迅速贴壁,经换液完全汇合时镜下 可见细胞排列紧密,无序生长,经传代培养3代后细胞形态 未见明显变化,经流式细胞学检测MSCs的标志抗原CD29、 2 中文摘要 特性。 2、化学萃取后的脊髓依然呈长扁圆形,但直径有所增粗, 后正中裂距离加宽,乳白色、质软。HE染色可见经化学方法 萃取的脊髓横切片中无任何细胞,质地较致密,内可见蜂窝 状网格。扫描及透射电镜可见去细胞髓芯的髓鞘、细胞等结 构均消失,整个视野由板层样结构组成,神经纤维间基质和 基底膜形成圆形较规则、均一的腔隙。特别是扫描电镜支架 中存在神经元被化学萃取后残留的“空穴”,其大小与神经元 仍呈长扁圆形,但直径变小,硬度有所增加,断面可见组织 块更加致密。 3、天然生物膜材料肉眼下为带有脑脊液通道的螺旋凸梁 式圆管状。生物膜圆管切开后,扫描电镜观察断面及内表面。 断面可见该生物膜圆管呈分层状,由数层膜压制而成,而且 部分膜之间夹有数层较厚的材料。内表面在电镜下观察可见 胶原样结构呈蜂窝状。 4、人脐带MSCs接种于包被生物膜圆管的脊髓生物支架 内行体外条件养后,取48、72、96小时三个时问段,分别行 冰冻切片HE染色、扫描电镜观察。冰冻切片HE染色见萃取 的脊髓生物支架中有细胞在蜂窝样结构内生长,细胞呈点状、 星芒状散居于间质之间

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