小鼠内皮抑素基突变体的克隆表达及功能的初步研究.pdfVIP

小鼠内皮抑素基因突变体的克隆表达 及功能的初步研究 硕士研究生：黄晓华 指导教师：左云飞 教授 专业名祢：临床检验诊断学 摘 要 新生毛细血管的生长是恶性肿瘤生长的中一tl,环节。肿瘤发生的早 期伴有新血管的生成，而且新血管生成的速度限定了肿瘤生长的速度。 在血管生成抑制剂的作用下，转移瘤处于“休眠”状态，并且可以使 肿瘤细胞的增殖与凋亡达到平衡而抑制肿瘤的生长。作为目前公认的 较强的内源性肿瘤血管生成抑制剂一一内皮抑素受到越来越多的关 注。 培养液中提取的一种内源性血管生成抑制剂。测序表明内皮抑素是胶 原XⅧC末端的一个片段。内皮抑素抑制血管生成的特异性功能位点 尚不清楚，对内皮抑素类似物片段活性也无明确报道，但该片段适当 增减一定数量的氨基酸被认为仍有相似的抗血管生成活性。有数据表 明，在N端增加不同多肽片段的重组内皮抑素蛋白或去除内皮抑素N 末端的5个氨基酸，对内皮抑素的体内和体外活性均无明显影响。但 目前为止对于C末端氨基酸数量的增减对内皮抑素活性影响的研究较 少。 本课题试图研究内皮抑素C末端的氨基酸序列与内皮抑素的生物 学活性之间的关系。本次实验在设计引物时选择性的去除了内皮抑索C 末段的7个氨基酸(FMTSFSK)相对应的碱基序列得到内皮抑素的突变 体EM7。用基因工程的方法构建了原核表达载体pBV220-EM7，并将 ·1‘ a中，初步分离 pBV220．EM7与pBV220．Endostatin转入大肠杆菌DH5 纯化表达蛋白并进行体外活性实验检测改性后内皮抑素的活性，通过 与全长内皮抑素的比较研究去除c末端的氨基酸是否会影响内皮抑素 的抗血管活性。为此作了以下工作： 1．以本教研室保存的质粒表达载体pBV220．Endostatin为模板， I和EcoR 设计合成的一对分别带有BamH I的限制性内切酶识别位点 的特异性引物，PCR法扩增EM7基因片段并引入上述两个酶切位点。 2．用BamHI和EcoR I酶切PCR产物及pBV220，将目的基因插 入质粒pBV220中，构建重组质粒pBV220．EM7，将重组质粒转化至大 肠杆菌DH5 a中并筛选阳性克隆，用双脱氧末端终止法测序，结果表 明与已知小鼠内皮抑素C末端去除21个碱基的基因序列一致。 菌中表达外源蛋白。并用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测表达产物。 4．将表达蛋白初步分离纯化，并利用初步纯化的蛋白进行鸡胚绒 毛膜尿囊实验(CAM)。结果表明重组质粒pBV220．EM7、 制新血管的生成。 本实验成功克隆了EM7基因，构建了重组质粒pBV220．EM7，并 a中。诱导改性后内皮抑索及完整的内皮 将质粒转化至大肠杆菌DH5 抑素蛋白的表达，并对表达的蛋白进行初步纯化。通过CAM实验证明 改性后的内皮抑素仍具有抑制新血管生成的功能，提示C末端7个氨 基酸对内皮抑紊的生物学功能并无影响。该研究为肿瘤用药、肿瘤的 早期诊断及应用基因工程的方法制各内皮抑素抗体等奠定了一定的基 础。 关键词：内皮抑素 血管生成 突变体 生物学功能 mutantand mouseendostatin’S The of construction itsfunction of research theinitial Master