小鼠il-23因在小鼠结肠癌细胞中的表达及其抗肿瘤作用研究.pdfVIP

中文摘要 小鼠IL一23基因在小鼠结肠癌细胞中 的表达及其抗肿瘤作用研究 摘 要 目的：肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。目前，手 术治疗、放疗、化疗仍然是治疗的主要手段。但由于肿瘤分 级、分划和生长部位等因素限制许多肿瘤不适合于手术切 除。在肿瘤的放疗、化疗中，并非所有肿瘤细胞均对之敏感 或均适宜应用，而且长期的放疗、化疗还可损伤机体的免疫 系统，甚至影响其他一些重要组织器官的功能，诱发新的疾 病。因此，十分需要发展肿瘤治疗的新方法。目前，肿瘤的 免疫治疗成为肿瘤治疗中研究的热点。将细胞因子基因导入 肿瘤细胞，使其自行分泌细胞因子，并在肿瘤局部形成高浓 度聚积，不仅可避免全身应用细胞因子带来的毒副作用，又 可使细胞因子在局部获得持久表达，有利于免疫反应的激发 和维持，展示出细胞因子基因治疗肿瘤的诱人前景，日益受 到人们的关注。 IL．23是Oppmann等在2000年新发现的一种新的细胞 因子，由p19和p40曲个亚基由二硫键连接组成的异二聚体。 诱导T细胞增殖并产生IFN-．1,等细胞因子，促进人和鼠记忆 性T细胞的形成和增殖，激活DC及促进CTL活性。IL．23 的上述特性使之不仅可增强抗肿瘤的细胞免疫应答，而且还 可通过发挥记忆性T细胞的功能，防止肿瘤的复发。因此， IL．23基因有可能作为肿瘤基因治疗的候选基因。IL一23是否 具有设想的抗肿瘤作用，国内尚无研究报道。因此，本研究 中文摘要 在已有工作的基础上首先以结肠癌细胞株(Colon26)为基 础，构建表达Ⅱ．23的结肠癌细胞株(Colon26／IL．23)，为深 入研究IL-23的抗肿瘤作用，皮下接种小鼠观察IL．23的抗 肿瘤作用，并进一步探讨IL．23抗肿瘤过程中细胞凋亡的变 化及细胞凋亡抑制因子Survivin的表达情况。 方法：将携带raiL．23的逆转录病毒包装细胞株 件下培养24h，收集带有mlL一23基因的重组逆转录病毒的上 清液。以polybrene介导将携带naiL．23基凶的逆转录病毒转 筛选，得到稳定转染的阳性克隆细胞(Colon26／IL．23)。用 DMEM培养这些稳定转染阳性克隆细胞，待细胞呈对数生长 时，用饱和酚．氯仿法提取阳性克隆细胞DNA，PCR鉴定目 的基因是否整合到小鼠结肠癌细胞基因组中。用Trizol提取 mRNA的表达。用ELISA方法检测细胞培养上清液mlL．23 分泌量。无菌取6周龄BAEB／c小鼠脾脏，制成脾细胞悬液， 加入Colon26／IL．23细胞培养上清液，培养48小时，收集上 清液，用ELISA方法检测IL一23刺激牌细胞产生IFN．Y的含 C010n26／LxSN的体外增殖反应。将上述三种细胞分别接种 8．10周龄BALB／c小鼠，观察其致瘤作用，并用游标卡尺定 期测量肿瘤大小，确定IL．23的抗肿瘤作用。8．10周龄 BALB／c小鼠随机分为四组，分别皮下接种Colon26／IL一23、 取瘤组织用流式细胞仪检测瘤细胞凋亡率、用免疫组织化学 中文摘要 的方法检测瘤细胞中细胞凋亡抑制因子Survivin的表达情 况。 结果：含naiL一23的PA317／IL．23细胞培养上清液与小鼠 结肠癌细胞共同培养获得稳定转染的阳性克隆细胞 Colon26三种细胞的基凶组DNA，经PCR扩增后琼脂糖凝 胶电泳，只在Colon26／IL一23细胞中扩增出长度约为581b口 的naiL．23 p19砸基基因的PCR产物。将三种细胞的总RNA 经肼pCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳发现只在 大小相同的约581bp的带。只在Colon26／IL．23细胞的培养 上清中检测到mIL．23的分泌，分泌量为(95±1．76p咖1)。 Colon26／IL。23细胞培养上清液刺激小鼠脾细胞IFN．Y分泌 1)。 三种细胞体外增值无明显差异(P0．05)、而在体内致肿瘤作 用不I劂，在Colon26／IL．23细胞接种后的早期肿瘤生艮的速 生长的速度变缓慢，接种后30d瘤体明显减小，42d开始有 小鼠肿瘤消退(P0．01)。流式细胞仪检测，接种 Colon26／IL。23