抗原致敏il-2基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究.pdfVIP

抗原致敏IL．12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究 抗原致敏IL．12基因修饰的树突状细胞 诱导抗肾癌免疫的体外研究 专 业：外科学 硕士研究生：罗道升 导 师：戴宇平教授 摘要 Cell 背景：‘肾癌(RenalCarcinoma，RCC)是最常见的肾脏实质性恶性肿瘤。 l肾癌的关键治疗手段是根治性肿瘤切除术，但对晚期转移性肾癌、术后复发不能 再手术治疗的‘肾癌，目前尚无有效的治疗方法；肾癌对放疗、化疗均不敏感；肾 癌是一种免疫原性很强的肿瘤，所以肾癌的免疫治疗有潜在优势。然而，由于免 疫耐受等原因目前肾癌的免疫治疗疗效还不满意。很多机制参与了肾癌逃脱机体 免疫监视，如缺乏足够数量和有活力的树突状细胞(dendriticcell，DC)：肾癌细 胞低表达肿瘤抗原或肿瘤抗原变异；肿瘤浸润性淋巴细胞的增殖、定向移位和细 胞毒能力减弱；肿瘤分泌免疫抑制因子增多，致使肿瘤抗原不能被有效识别和提 呈。 树突状细胞在肿瘤免疫中的基础地位确立以来，肾癌的免疫治疗取得了较大 的进展。树突状细胞是目前公认的体内功能最强的抗原提呈细胞(antigen cell，APC)，是机体内启动免疫反应的关键因素。DC摄取肿瘤抗原， presenting T 提呈抗原给T淋巴细胞，诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxiclymphocytes，CTL) 增殖、活化，产生特异性抗肿瘤细胞免疫。DC与肿瘤关系密切，癌组织中DC 的数量是肿瘤预后的重要参数之一，荷瘤宿主体内存在一定数量的DC，但DC 的数量、形态、表型异常，免疫能力差，因此，构建一种以DC为基础的瘤苗， 对DC进行一定的修饰，以改善肿瘤局部的微环境、增强DC的免疫功能，进而 遏制肿瘤免疫逃脱。 本研究将能发挥重要抗肿瘤作用的IL．12基因转染DC，再用肿瘤粗提抗原 抗原致敏IL-12蕈因修饰的树突状细胞诱导抗肾癌免疫的体外研究 致敏DC．构建成一种以DC为基础的多价瘤苗，使其在有效提呈抗原的同时又 持续高分泌IL．12因子，更有效地诱导T淋巴细胞增殖、活化，进而诱导特异性 抗肿瘤免疫。从分子及细胞学水平观察DC多价瘤苗体外诱导自体T淋巴细胞产 生特异性抗肾癌免疫的效能，并对结果进行分析。 目的： 1．第一部分：树突状细胞的体外扩增培养 对传统培养方法改良．掌握从外周血单个核细胞(PBMC)中分离培养DC 的方法。 2．第二部分：以树突状细胞为基础的DC多价瘤苗的制备 联合用肿瘤抗原致敏和IL．12基因修饰方法，构建一种以DC为基础的多价 瘤苗，并从分子水平上检测该瘤苗的免疫状态。 3．第三部分：DC多价瘤苗诱导抗肾癌免疫的体外实验 在体外用DC多价瘤苗诱导T淋巴细胞增殖、活化，从细胞水平上检测该瘤 苗的免疫效能。 材料与方法： 1．第一部分：树突状细胞的体外扩增培养 取RCC患者的外周血，用淋巴细胞分离液分离得到PBMC，PBMC在细胞 因子GM．CSF、IL．4作用下培养，第7天收集细胞，倒置相差显微镜下观察细胞 的表达情况，计算DC的数量和判断DC的纯度与成熟度。 2．第二部分：以树突状细胞为基础的DC多价瘤苗的制备 以重组逆转录病毒为载体携带IL．12基因修饰DC，再用肾癌细胞粗提抗原 子的分泌水平。 3．第三部分：DC多价瘤苗诱导抗肾癌免疫的体外实验 各组DC瘤苗与T淋巴细胞混合培养，诱导、刺激T淋巴细胞增殖、活化， II 垫堕致敏IL-12基因修饰的树突状细胞诱导抗肾痛免疫的体外研究 肾癌细胞为靶细胞，各组CTL为效应细胞，MTT法从细胞血水平检测不同效靶 比时CTL对肾癌细胞的杀伤效能。 结果： 1．第一部分：树突状细胞的体外扩增培养 周后，DC呈集落增殖，由1，5×105增至1．5×106，细胞有大量树枝状突起，为悬 (36．8％)、HLA—DR(99．6％)、CDl4(5．6％)。 2．第二部分：以树突状细胞为基础的DC