抗重组人卵透明蛋白-3肽段huzp3alt;#39;22-176gt;和huzp3blt;#39;177-348gt;抗体的制备及鉴定.pdfVIP

及其鉴定 中文摘要 哺乳动物的卵透明带(zonapellicida，ZP)在受精过程中承担着重要的 功能，其中ZP3蛋白是精子结合卵细胞的初始配体，并且能够诱发顶体反应。由 于ZP3在受精中的重要作用，它成为探求不孕不育的分子机制、体外受精(IVF) 的评估与改善以及免疫避孕等多项研究的有效靶蛋白。碍于医学伦理学的限制， 人卵巢组织及成熟卵细胞均很难获得，从天然的zP中分离纯化各组分蛋白更是 难以实行。因此，为了开展相关研究，通过基因工程直接获取人ZP(huZP)各组 分蛋白就成为切实可行的途径。本研究通过PCR技术，将去N端信号肽和C端跨 膜区的huZP3””蛋白编码基因拆分成大小相近的两段，以完整阅读框的形式分 别重组插入热诱导型pBV221的多克隆区，使大肠杆菌特异地表达了可单独或复 完成了两者表达产物的分离纯化。huZP3a和huZP3b的可获得性为开展两者的免 疫原性以及huZP3诱发人精子顶体胞吐的功能域等研究奠定了基础。 白，进一步主动免疫家兔，产生了兔抗huZP3a””及huZP3b”’”多克隆抗血清 与各自的重组蛋白起特异的抗原抗体结合反应。采用分别含有这两段肢中部分氨 327—340) 这两段肽，具有较高的滴度，显示其各自具有良好的免疫原性。 为了明确重组huZP3a“”及huZP3b”’…蛋白及其抗血清能够用于诱导人精 子顶体胞吐作用和干预正常人精卵结合等体外功能性研究，我们采用AS—ZP3a 和AS—ZP3b与正常人卵巢组织以及成熟的人卵细胞中的天然ZP组分进行免疫组 化检测，结果均出现十分明显的着色反应，且采用不同抗体，着色的深浅并无显 表位进行有效结合，为进一步筛选参与精卵初始结合与诱导顶体胞吐作用的功能 性表位奠定了基础。我们也通过竞争性的半带试验证实了AS—ZP3a和AS—ZP3b 均能明显抑制人精子一透明带的体外结合。 总而言之，重组表达的huZP3a”“”及huZP3b”7“8蛋白都具有强免疫原性和特 4 异性，因此，单一或合并两个huZP3肽可作为抗原建立检测不明原因不孕妇女中 是否存在抗自身ZP抗体的Kit，另外它们的抗血清也可用于鉴定已明确huZP3 表位肽的最小B一细胞表位顺序。 关键词人卵透明带多克隆抗血清免疫组化半带测定 中图分类号：R392．11 5 Abstract Themammalianzona has inthe pellucidaan function important fertilizationzona 3(ZP3orZPC)isthe process．Thepellucidaprotein for andinducestheacrosomereaction．As 1igandprimaryspermbinding its in most role becomesoneofthe key fertilization，it pivotaltarget inthe ofmolecularmechanismsof and proteins sterility study infertility， evaluationand of in v