第五章酶和细胞的固定化要点.ppt

优点： 不溶于水，易于与产物分离； 可反复使用； 可连续化生产； 稳定性好。 缺点： 固定化过程中往往会引起酶的失活 5.2 固定化酶的研究历史 固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的格仑布霍费(Grubhofer)和施莱思(schleith)采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。 60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千钿一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。 在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。 5.3 酶固定化技术 ①必须注意维持酶的催化活性 活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。 （1）吸附法 包括物理吸附和离子交换吸附法。 ①物理吸附法 是通过氢键、疏水键和范德华力等物理作用力将酶固定于不溶性载体的方法。 无机吸附剂的吸附容量一般很低，常小于1mg蛋白/g吸附剂。有机吸附剂的吸附容量通常高一些，例如，火胶棉膜对木瓜蛋白酶、碱性磷酸酯酶以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的吸附容量可达70mg蛋白/厘米2膜；胶原膜对β-D-果糖呋喃糖苷酶、溶菌酶、脲酶、葡萄糖氧化酶以及青霉素酰胺酶等的吸附容量可达50mg蛋白/g胶原膜。 无机吸附剂的另一缺点是常易使某些酶发生吸附变性，而有机吸附剂一般不会产生这种情况。 ②离子交换吸附法  是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换剂的相互作用而达到酶的固定化的方法。 最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其它还有各种合成的离子交换树脂:如Am-berlite XE-97、Dowex-50等。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂，通常为50-150mg蛋白/g载体。 ③操作方法 实验室常用的方法是混合、震摇装载法，即将载体与酶混合后，要在搅拌下或摇床连续震摇下完成固定化，此法固定化较均匀，关键在于控制适当的搅拌和震摇速率，既不要破坏酶和载体的结构，又要达到混合的目的。 如将10ml 2%(W/V)的葡萄糖淀粉酶溶液在pH4.8，30℃条件下以活性炭为吸附剂，搅拌15分钟后过滤出去滤液，所得酶的吸附剂结合物，经洗涤（除去不吸附的酶），即可得固定化葡萄糖淀粉酶。 电沉积法：在酶溶液中放置两个电极，在电极附近加入载体，接通电源，酶移向电极，并沉积到载体表面。该法要求事先确定载体和酶是否会在电场中分解破坏。 反应器装载法：工业上常用，特点是将固定化和其后的应用连在一起，即先将载体装于反应器中，再加上酶溶液，然后通过循环震动方式使酶和载体达到充分混合。 吸附法小结 吸附法的优点：操作简便，条件温和，酶分子的构象很少或基本不发生变化，吸附剂可再生反复使用。 吸附法的缺点：酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的pH、高盐浓度、高底物浓度或高温条件下解吸脱落。 （2）共价结合法 这是借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联以制备固定化酶的方法。 ①固定化载体 载体的物化性质直接关系到固定化酶的形成和性质。一般来说理想的载体： 应是亲水的 　因为疏水载体对酶会起跟有机溶剂一样的变性作用； 表面积大（粒细而多孔） 　从而使单位体积的固定化酶具有较高的活力 有一定的机械强度和稳定性，使固定化酶可长期使用； 带有在温和条件下可和酶的侧链基团进行共价结合的功能基团 根据这些要求，常用的载体有天然高分子衍生物如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖等； 也有合成的高聚物如聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、尼龙等； 还有无