中华眼镜蛇l-基酸氧化酶的分离纯化及其体外抗肿瘤作用.pdfVIP

摘 要 L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase, LAAO ）是蛇毒中的重要毒性成分， 具有复杂多样的生物学功能，包括抗肿瘤活性。本文从中华眼镜蛇毒中分离纯化 LAAO ，鉴定其纯度和理化性质，并对其体外抗肿瘤作用、诱导细胞凋亡作用及 机制进行研究，为其可能的应用提供实验依据。 1. 中华眼镜蛇L-氨基酸氧化酶的纯化与鉴定 通过凝胶过滤、疏水层析和离子交换层析法从眼镜蛇粗毒中分离 LAAO 并 鉴定其理化性质，结果：①通过凝胶过滤、疏水层析和离子交换层析法从眼镜蛇 粗毒中分离得到LAAO ，每500 mg 蛇毒中可纯化得到6 mg LAAO，蛋白回收率 1.2 %，酶活力回收率43.3 % ，通过分子筛和RP-HPLC 和SDS证实其是 均一蛋白；②NA-LAAO 由两个相同的亚基组成，每个亚基的分子量是55 kDa， 全酶分子量120kDa；③通过肽质量指纹图谱鉴定，发现该蛋白序列与眼镜蛇L- 氨基酸氧化酶cDNA 高度相符。 2. 眼镜蛇L-氨基酸氧化酶体外抗肿瘤细胞增殖作用及机制 采用CCK-8 法测定NA-LAAO 的细胞毒性及对细胞生长增殖能力的影响； 采用流式细胞术、实时定量PCR 和Western-blot 等方法分析NA-LAAO 对ECV304 细胞周期相关基因mRNA 和蛋白质表达的影响。结果：①CCK-8 实验显示， NA-LAAO 对体外培养的肿瘤细胞的生长有强烈抑制作用，且呈剂量-效应和时 间-效应关系。NA-LAAO 处理6 h、12 h、24 h 对K562 的半数抑制浓度（IC50 ） 分别为0.80、0.38 和0.25 µg/ml ；对ECV304 为1.54、1.09 和0.48 µg/ml ；对MGC803 为2.48 、1.74 和0.83 µg/ml ；对U251 为3.18、1.79 和0.88 µg/ml ；对A549 为15.4、 6.78 和2.61 µg/ml ；不同细胞株对NA-LAAO 的敏感性存在较大差异；②细胞增 殖实验显示，0.156 µg/ml 的NA-LAAO 作用4 天以后，可明显抑制ECV304 细 胞增殖；0.313 µg/ml 的NA-LAAO 第2 天起就有明显效果；0.625 µg/ml 的 NA-LAAO 处理后，细胞多数死亡；③流式细胞术分析提示NA-LAAO 可影响 ECV304 的细胞周期，使细胞阻滞在G1 期，并呈量效关系；④实时定量PCR 结 果显示，NA-LAAO 可下调Cyclin A2、B1 、D1 、E1 ， CDK2 、CDK6、Survivin、 Skp2，上调p21 、p16 、p27 的表达，Western-blot 结果显示NA-LAAO 可下调Cyclin 1 A 、CDK2、CDK6 ，上调p21 ，与定量PCR 一致，可能与其阻滞细胞周期有关。 3. 眼镜蛇L-氨基酸氧化酶诱导肿瘤细胞凋亡及机制 本研究通过AO/EB 染色、DNA 含量测定、Annexin V/PI 染色、线粒体膜电 位测定、Caspases 和PARP 切割实验等方法，探讨NA-LAAO 对肿瘤细胞凋亡的 影响；通过实时定量PCR 和Western-blot 分析NA-LAAO 对凋亡调控蛋白Bcl-2 家族分子的影响，探讨NA-LAAO 诱导细胞凋亡的机制。结果：①AO/EB 形态 学观察发现，低剂量NA-LAAO 可使细胞出现凋亡样特征；流式细胞术检测发现， NA-LAAO 可使细胞的DNA 含量降低，出现亚二倍体DNA 凋亡峰；Annexin V/PI 双染检测发现，NA-LAAO 可使细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻；流式细胞术检测发现， NA-LAAO 处理8 h 可使ECV304 细胞中的JC-1 发生从红色荧光到绿色荧光的转 变，这些结果说明 NA-LAAO 可诱导肿瘤细胞凋亡；②NA-LAAO 处理可使 Caspase-9、Caspase-3 活化，并降解Caspase-3 底物PARP-1 ，提示NA-LAAO 可 激活内源性凋亡途径；③高浓度NA-LAAO 导致的细胞死亡不受Caspases 抑制 剂z-VAD-fmk 影响，提示NA-LAAO 可诱导不依赖于Caspases 的细胞死亡；④ 实时定量PCR 和Western-blot 结果显示，NA-LA