10章组学研究技术要点.ppt

荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH） 克隆作图 什么是生物信息学 ？ 基因组功能分析技术 基因分离技术 差异基因分离技术 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression ) 基因芯片技术 遗传连锁分析 位点关联分析； 双杂交技术 蛋白组学 基因封闭技术（反义核酸、核酶、RNAi、基因剔除） 基因替代技术（基因转移、可控性基因表达） 蛋白修饰技术 生物信息学分析技术 基因功能研究技术 ◆ 变性高压液相色谱 (DHPLC) (denaturing high-performance liquid chromatography) ◆ 基质辅助激光解吸飞行时间质谱 (MALDI-TOF) (Matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight ) ◆ DNA Chip ◆ SSCP(单链构像多肽性) ◆ 动态特异等位基因杂交 （dynamic allele-specific hybridization） SNP大规模分离检测技术 新基因功能研究策略 基因表达系列分析 SAGE （serials analysis of gene expression） 1995 Velculescu 及其同事年创立 原 理 来自转录物内特定位置的一小段寡核苷酸序列（9~11bp）含有鉴定一个转录物特异性的足够信息，可作为区别转录物的标签（tag）； 通过简单的方法将这些标签串联在一起，形成大量多联体（concatemer），对每个克隆到载体的多联体进行测序，并应用SAGE软件分析，可确定表达的基因种类，并可根据标签出现的频率确定基因的表达丰度（abundance）。 1. 将5μg含有oligo dT（引物）的磁珠与RNA混合。 2. 合成双链cDNA。? 3. 用NlaⅢ酶消化形成一条链末端有标签的产物。? 4. 将样品分成两份，连接成含有识别序列的产物，以备用BsmF1消化。 5. 用Mme I切割每一个样品形成约60bp的标签。 SAGE 步骤 磁珠 磁珠 磁珠 磁珠 磁珠 磁珠 识别序列 识别序列 标签 6. 延伸5秒，连接成约130bp的双链标签。? 7. PCR扩增。 8. 用Nla Ⅲ酶切130bp产物释放34bp双链标签。 9. 连接片断形成串联体。? 10. 克隆到pZErO-1+里， 并测序。? 连接 扩增 SAGE实例 锚定酶辟分 AE 一半结合结头B 一半结合结头A 标签酶辟分 TE 标签酶 辟分 TE 连接、用引物A、B扩增 双标标签 锚定酶辟分 分离双标标签 连接、用引物A、B扩增 串联克隆 双标标签 双标标签 S A G E SAGE特点： 研究转录物组~转录水平； 可寻找较低丰度的转录物， 最大限度地收集基因组的基因表达信息； 快速详细分析成千上万个EST，寻找表达丰度不同的SAGE标签序列，完整获得基因组的表达信息； SAGE可用于在不同环境、不同生理状态及不同生长阶段的细胞和组织表达图谱构建，对不同状态下基因表达水平的定量或定性比较，特别是对疾病组织与正常组织的比较发展迅速； 生 物 信 息 学 技 术 读懂“天书” 生物信息学技术 读懂“天书” 建立生物学信息系统框架 支持生物学的信息管理系统 分析工具 通讯网络 即传统的生物信息学 （Bioinformatics） 两个交叉领域的工作 ~~生物信息学计算机技术 基于计算理解基本生物学问题 即计算生物学（Computational Biology） ◆ 基因组信息的收集、储存、管理与提供 ◆ 新基因的发现与鉴定 ◆ 非编码区信息结构分析 ◆ 生物进化的研究 ◆ 完整基因组的比较研究 ◆ 基因组信息分析的方法研究 ◆ 大规模基因功能表达谱的分析 ◆ 蛋白质分子空间结构预测模拟和分子设计 ◆ 药物设计等。 研究内容与应用范围 EST数据库（包括SAGE数据库） STS数据库（遗传标记，电子PCR） SNP数据库 蛋白数据