酶化学修饰分析报告.pptVIP

第三章 酶蛋白的化学修饰 第六节 酶化学修饰的应用 酶分子修饰的目的： 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 提高酶的活力 增强酶的稳定性 降低或消除酶的抗原性 酶化学修饰的应用 化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 化学修饰酶在医学和生物技术中的应用 蛋白质化学修饰的局限性 一、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 1. 研究酶空间的结构 用化学修饰法确定某种氨基酸残基在酶分子中所存在的状态时常有的方法。 通常，酶分子表面基团能与修饰剂反应，而不能与修饰剂反应的基团一般是埋藏在分子内或形成次级键。 一、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 2. 确定氨基酸残基的功能 化学修饰与底物保持相结合，可用于研究底物对修饰速度和修饰程度的影响。如果修饰反应的可逆性对应着生物功能的改变，可确定某一残基的可能功能提供一定的依据。如在丙酮酸激酶，精氨酸残基的修饰反应过程中，伴随着精氨酸残基的修饰，酶分子可逆地失活，底物保护作用说明酶分子在底物磷酸式丙酮酸的磷酸结合位点具有一个必须的精氨酸残基。 一、化学修饰在酶的结构与功能研究中的应用 3. 测定酶分子中某种氨基酸的数量 当需要测定某一种氨基酸的数量时，就可以用定量的化学修饰方法，如用三硝基苯磺酸测定氨基。 二、化学修饰酶在医学和生物技术中的应用 作为生物催化剂的酶存在的问题： 酶是生物催化剂，它具有底物专一性强、催化效率高和反应条件温和等显著特点，但是与化学催化剂相比较,又有很多缺点 医用酶：其异体蛋白质的抗原性由于受蛋白质水解酶水解和抑制作用、在体内半衰期短，不稳定，不能在靶部位聚集、不合适的最适pH等缺点严重影响医用酶的使用效果，甚至无法使用。 工业用酶：酶蛋白抗酸、碱和有机溶剂变形能力差，不耐热，容易受产物和抑制剂的抑制，工业反应要求的pH和温度不在酶反应的最适pH和最适温度范围内，底物不溶于水或酶的pk高等缺点，限制了酶制剂的应用范围。 酶化学修饰 酶的表面化学修饰 大分子修饰 小分子修饰 交联修饰 固定化修饰 分子内部修饰 结合定点突变的化学修饰 1 酶的表面化学修饰 （1）大分子修饰 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。 最常用的修饰剂——PEG类修饰剂 聚乙二醇 polyethyleneglycol, PEG ： ?无免疫原性和毒性，不破坏酶分子活性， ?生物相容性好， FDA 认证 ?PEG分子量范围宽，适合相对分子质量一 般为500～20000。 ? PEG既溶于水，又溶于绝大多数有机溶 剂，但不溶于乙醚、脂肪烃。 单甲氧基聚乙二醇（MPEG）只带有一个可被活化的羟基，它有一类重要的衍生物——均三嗪类衍生物，包括MPEG1和MPEG2， MPEG的羟基与均三嗪即三聚氯氰的氯反应，控制不同的反应条件，可分别得活化的MPEG1和MPEG2，被三聚氯氰活化的修饰剂引入了活泼的氯，可与酶的氨基反应。因为MPEG1在一个三聚氯氰环上只连一个MPEG分子，MPEG2在一个三聚氯氰环上连两个MPEG分子，所以氨基修饰程度相同时，MPEG2修饰酶所引进的MPEG分子数是MPEG1的二倍，MPEG2修饰效果较好。 PEG的应用 a L-天冬酰胺酶 L-天冬酰胺酶具有较强的抗肿瘤作用，它能将肿瘤细胞生长所需的L-天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，从而特异并有效地抑制肿瘤细胞的恶性生长。天然的L-天冬酰胺酶制剂静脉注射过后清除速率过快，根据酶来源不同和个体的差异，酶在体内的半衰期只有6-20h，反复注射还会刺激人体的免疫系统产生抗原-抗体反应，增加酶的清除速率，并可能产生严重的过敏反应。采用PEG进行修饰不仅可降低或消除酶的抗原性，且可以提高酶的抗蛋白质水解的能力，延长酶在体内的半衰期，提高药效。 PEG的应用 （b）超氧化物歧化酶 SOD 超氧化物歧化酶 SOD 是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能催化进行歧化反应，是氧自由基的天然清除剂，可清清除细胞外液中存在的的超氧负离子 O2- ，对红斑狼疮、皮炎、结肠炎及氧中毒等疾病有显著疗效。不管用何种给药方式，SOD 均未发现有明显的副作用,抗原性也很低。所以SOD是一种多功效低毒性的药用酶。SOD的主要缺点是它在体内的稳定性差,在血浆中半衰期只有6～10min，且存在异体蛋白质抗原性。通过PEG化学修饰超氧化物歧化酶，可以大大增加其稳定性，酶活力保持在51%，在血液中停滞时间延长，抗炎活性提高，为SOD 的临床使用创造了条件。 （c）制造新型酶催化剂 MPEG共价修饰的过氧化氢酶在有机溶剂中的溶解性和酶活力也得到提高，在三聚乙烷中酶活力是天然酶的20