原核基因表达(乳糖色氨酸)技术方案.ppt

5.1.1 原核基因调控机制的类型与特点 原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同可分为： 正、负转录调控系统 在正转录调控系统（正控）中，调节基因的物质是激活蛋白（ activator ）－－开启结构基因转录。其作用部位是操纵区。它与操纵区结合，转录开启。 在负转录调控系统（负控）中，调节基因的物质是阻遏蛋白(repressor)－－阻止结构基因转录。其作用部位是操纵区。它与操纵区结合，转录受阻。 可诱导调节：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。 例：大肠杆菌的乳糖操纵子 分解代谢蛋白的基因 可阻遏调节：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。 例：色氨酸操纵子 合成代谢蛋白的基因 酶合成的阻遏操纵子模型 5．2 乳糖操纵子－－负控诱导系统 2、操纵子的定义 操纵子是一种完整的具有特定功能的细菌基因表达和调节的单位，包括调节基因，操纵位点，结构基因，组成一个控制单元 结构基因：产生mRNA,合成蛋白质 操纵位点 promotor,operator：启动子结合位点 调节基因：产生调节蛋白（与操纵位点结合） →结构基因不转录 诱导物存在时，可与阻遏蛋白结合 →结构基因转录 一、乳糖操纵子的结构 Z编码β-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖 Y编码β-半乳糖苷透过酶：使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。 A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。 5.2.2 酶的诱导现象 二、酶的诱导——lac体系受调控的证据 5.2.4 阻遏蛋白的作用机制 1 阻遏蛋白结构 38KD，4 聚体， 一个亚基结合一个IPTG分子 lacI 组成型转录 Pi 弱启动子， 5－10个／cell 具有二重性 阻止转录（与lacO结合） 开始转录（与诱导物结合） 阻遏蛋白单体的结构 （1）操纵基因突变（O+?Oc），结构基因组成型表达 （2）操纵子不可诱导型突变 （3）阻抑蛋白基因的I-突变 ②真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在β-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有β-半乳糖甘酶的预先存在。 解释： 本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。 2、大肠杆菌对乳糖的反应 培养基：甘油 按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷透过酶； 培养基：加入乳糖 少量乳糖 3、阻遏物lacI基因产物及功能 Lac 操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有5-10个阻遏物分子。 当I基因由弱启动子突变成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导。 4、葡萄糖对lac操纵子的影响 如果将葡萄糖和乳糖同时加入培养基中， lac操纵子处于阻遏状态，不能被诱导；一旦耗尽外源葡萄糖，乳糖就会诱导lac操纵子表达分解乳糖所需的三种酶。 代谢物阻遏效应 5.3 色氨酸操纵子（trp operon） 内容提要： 色氨酸操纵子的结构 色氨酸操纵子的阻遏系统 色氨酸操纵子的弱化机制 Trp operon 基因组成 trpR, 阻遏蛋白 P ： -40～+18 O ： -21 ～ +1 L ： +1 ～ +162 结构基因 特点: (1) trpR和trpABCDE不连锁； (2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator)/弱化子 (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开 阻遏蛋白＋trp → 有活性的阻遏物 SNE299 2 阻遏蛋白的结合位点 trpO -21 ~ +1，反向重复序列 trpP -40 ~ +18 活性阻遏物与trpO 的结合与RNA pol与启动子的结合发生竞争 SNE299 3 阻遏系统 主管转录是否启动， 在缺乏Trp时， mRNA起始合成，但不能自动延伸，一般在trpE之前终止转录 三、trp 操纵