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超高效液相色谱的应用现状和发展前景 生物分离工程课堂报告之—— Speaker:黄妙珍 09生物技术三班 2011.11.3 色谱分离精度高，设备简单，操作方便，根据各种原理进行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析和检测，而且广泛应用于生物物质的制备分离和纯化。是目前最好的生物纯化技术。 常见的分离方式 蒸馏 离心 电泳 过滤 超滤 色谱 色谱分类 4 2 3 1 色谱 柱状色谱 薄层色谱 纸色谱 色相色谱 高效液相色谱 超高效液相色谱 色谱典型的仪器配置 分离度 色谱条件的优化 速度 容量 开发液相色谱方法 分辨率是色谱分离中主要考虑的因素 在开发色谱方法时，有很多因素是很重要的。除分辨率之外，以下几个因素都要考虑。 灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗 Click to add title in here 自20世纪70年代以来，随着高效液相色谱 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)技术的不断发展，美国Waters公司于2004年的匹兹堡会议上推出了最新研制的ACQUITY超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)，其采用1．7 Ixm细粒径的新型固定相，可获得高达2万块／m理论塔板数的超高柱效，并以系统整体设计的创新技术，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度，造就了液相色谱性能上的飞跃和进步并形成分离科学的一个新兴领域。 超高效液相色谱 Click to add title in here 超高效液相色谱 （UPLC）的原理 UPLC的理论基础为： 范德米特(Van Deemeter)方程 HETP=AdP+B／v+CdP2 HETP：理论塔板高度 A：涡流扩散系数 由该方程可得出结论： 颗粒度越小柱效越高；每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方向移动，而且有更宽的线速度范围所以降低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。 dlP：填料粒径 B：分子径向扩散系数 C：传质因子为流动相线速度 van Deemter曲线的提示 Click to add title in here Click to add title in here 如果填料的颗粒继续演变…… 未来的色谱:更小的颗粒度 液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。 小颗粒分离的理论与科学基础 更小颗粒度所面临的挑战 Click to add title in here 小颗粒带来生产力 基于1．7 m小颗粒技术的UPLC与人们熟知的高效液相色谱(HPLC)技术，具有相同的分离原理。不同的是，UPLC不仅比HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。使用UPLC可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果 --------UPLC的优点 超高分离度 图3: UPLCTM与HPLC：分离度比较 由右图可见：UPLCTM可以大大提高分离度，同时色谱峰强度也得到了提高。 小颗粒带来生产力 --------UPLC的优点 超高速度 图4: UPLC与HPLC：速度比较 图5：　UPLC美国药典有关物质分析实例 原有HPLC分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱，至少需要65分钟才能完成；UPLC使用了一根色谱柱、一种简单方法，在1分钟内即可完成。 小颗粒带来生产力 --------UPLC的优点 超高灵敏度速度 图6: HPLC到UPLCTM：灵敏度的改善无需折衷 UPLCTM使用小颗粒技术可以得到更高的柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽，即更高的灵敏度。 UPLC仪器构造 UPLC仪器构造 Click to add title in here UPLC仪器模式图 UPLC数据采集软件 Empower软件 MassLynx 为高性能质谱应用程序，用于采集、分析、管理和分布 UV 及质谱数据。它提供 了智能仪器控制，可以采集额定质谱、完全质谱、MS/MS 和完全质谱 MS/MS 数据。 MassLynx软件 Empower 具有基于图标和图形的用户界面，可用于采集、处理、管理、报告和存储色谱数 据。 UPLC的样品瓶和样品板 与UPLC匹配 的色谱柱比较少 峰面积的重复性欠佳 对高频检测仪器的需要 超高效液相色谱的局限性 尽管UPLC能显著减少复杂样品的分析分离时间，提