超滤质谱技术筛选板蓝根中抗流感病毒的活性成分.docVIP

超滤质谱技术筛选板蓝根中抗流感病毒的活性成分 　　[摘要] 目的：筛选板蓝根中抗流感病毒的活性成分。方法：采用超滤质谱技术，筛选板蓝根中具有抗流感病毒的活性成分，并以体外神经氨酸酶活性实验进行验证。结果：通过超滤质谱筛选并鉴定出与神经氨酸酶结合的成分主要是精氨酸、告依春和腺苷，其结合常数分别为（36.23±1.12）%，（32.54±1.02）%，（9.38±0.47）%；该结果与体外酶活性实验结果一致。精氨酸、告依春的IC50分别为（1.16±0.02），（1.20±0.02） g·L-1，腺苷的IC50大于500 g·L-1。结论：精氨酸和告依春可能是板蓝根抗流感病毒的活性成分，为板蓝根质量评价指标的选择提供了科学依据；亦为中药药效物质的发现提供了一种适宜技术。 [关键词] 超滤质谱；板蓝根；活性成分；神经氨酸酶抑制活性 [收稿日期] 2013-11-17 [基金项目] 国家自然科学基金项目 （座机电话号码， 座机电话号码， 座机电话号码） [通信作者] *鄢丹，Tel/Fax：（010）座机电话号码，E-mail： yd277@126.com；*肖小河，E-mail： pharmsci@126.com 板蓝根Isatidis Radix为临床常用中药，主要用于治疗上呼吸道感染等疾病，疗效确切，一般认为与其抗流感病毒药理活性相关[1-4]。由于板蓝根化学成分复杂，药效物质尚不明确，影响了其质量评控水平的提升及临床疗效的稳定发挥。现行药效物质筛选模式（植化分离、药理活性示踪、血清药物化学筛选等）在推动中药药效物质发现的同时，操作繁琐、活性成分易丢失等局限也日益显现[5-7]。因此，有必要探索高通量、灵敏的中药药效物质发现新技术。 超滤质谱技术是将超滤装置与质谱技术结合后形成的一种新方法，主要是利用亲和原理，将含有潜在活性的小分子物质与受体（靶部位如蛋白或酶等）混合，形成受体-配体复合物（采用超滤薄膜除去可能含有的未结合小分子），以有机溶剂处理并释放小分子配体，进一步采用液相-质谱联用技术对其进行鉴定，从而实现活性成分的快速初筛[8]。目前，该技术在先导化合物的发现、配体与受体结合强度以及相关机制等研究方面有较广泛的应用[9-14]。 神经氨酸酶作为抗流感病毒药物的主要作用靶点之一，可协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞[15]。板蓝根具有神经氨酸酶抑制活性[16-17]，本研究借助超滤质谱技术筛选板蓝根与神经氨酸酶结合的潜在活性成分，同时配以神经氨酸酶体外活性评价，以期发现板蓝根抗流感病毒可能的药效成分，将为板蓝根质量标准的提升以及中药药效物质的发现提供技术参考。 1 材料 Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters Xevo G2 Qtof质谱仪（美国Waters公司）；自动酶标仪（美国bio-tek公司）；超速离心机（德国Eppendorf 公司）；板蓝根购自安徽，经中国人民解放军第302医院中药研究所肖小河研究员鉴定为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort. 的干燥根；精氨酸（arginine），告依春（goitrin），腺苷（adenosinea）对照品购自中国食品药品检定研究院；2-（N-吗啡啉）-乙磺酸（MES）购自sigma公司，神经氨酸酶（neuraminidase， NA）（human H1N1）购自Sino biological公司；YM-100 超滤膜购自Millipore 公司；神经氨酸酶荧光底物2′-（4-methylumbelliferyl）-D-N-acetylneuraminic acid （MUNANA），奥斯他韦酸（Oseltamivir acid）购自Toronto Research Chemicals Lnc.；甘氨酸购自北京索莱宝科技公司。甲醇和乙酸均为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。 2 方法 2.1 样品制备 2.1.1 供试品溶液制备 取板蓝根药材粉末（过3号筛）约5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水50 mL，称定质量，加热回流1 h，放至室温，加水补足质量，滤过；取续滤液25 mL，浓缩至15 mL，放冷，加乙醇20 mL，静置使沉淀，离心，过滤；另取60%乙醇10 mL洗涤沉淀过滤器，合并上清液及滤液，浓缩至近干，加水溶解定容于5 mL量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，样品用于超滤实验和体外酶活性实验分析。 2.1.2 对照品溶液制备 告依春对照品用甲醇配成质量浓度为2 g·L-1的储备液；精氨酸对照品用甲醇配成质量浓度为10 g·L-1的储备液；腺苷对照品用甲醇配成质量浓度为10 g·L-1的储备液。 2.1.3 参照物溶液制备 取奥司他韦酸适量，精密称定，加水制成每1 mL含