骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体修复犬股骨头坏死模型的实验研究.docVIP

骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体修复犬股骨头坏死模型的实验研究 　　摘要：目的 探索骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体在骨坏死修复中的效果。方法 制备骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体，取23只杂种犬建立双侧股骨头坏死动物模型，随机分为三组。空白组不做任何治疗；单纯纳米骨植入组植入纳米骨；纳米骨+骨髓间充质干细胞组植入复合了干细胞的纳米骨。对植入后4、8、12w的股骨头行影像学观察以及组织学观察。结果 X射线检查：植入后12w，空白组犬股骨头有塌陷；单纯纳米骨植入组充填区与周围组织区别不明显，周边有新生骨小梁；纳米骨+骨髓间充质干细胞复合体植入组充填区近似周围组织，充填区分布有骨小梁。组织学观察：4w时，空白组股骨头坏死区无明显变化，其他两组植入物降解和新骨替代；8w时，空白组股骨头负重区软骨面部分缺损，其他两组坏死区初步修复，可见成骨和材料降解；12w时，空白组坏死区仍未修复，部分股骨头有塌陷，其他两组坏死区修复，纳米骨+骨髓间充质干细胞植入组骨小梁结构形成。结论 单纯纳米骨植入组和纳米骨+骨髓间充质干细胞植入组在股骨头坏死成骨方面效果优于空白组，纳米骨+骨髓间充质干细胞植入组成骨更佳。骨髓间充质干细胞与纳米晶胶原基骨复合体对早期股骨头坏死的治疗有较好的应用前景。 　　关键词：骨髓间充质干细胞；纳米晶胶原基骨；股骨头坏死；犬 　　股骨头坏死是一种对髋关节具有特殊破坏性的退行性病变，病程长且致残率高，严重危害人民的健康。对于成人早期股骨头坏死，行人工关节置换尚为期过早，因此如何有效地防止疾病的进一步发展，保护股骨头，延缓髋关节置换的手术时间，是值得关注的问题。股骨头坏死早期病程长，在进展至退行性髋关节病变晚期的3～5年间是可以逆转的，早期发现并给予一种安全、有效、微创的治疗是医患双方共同追求的目标。 　　骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一类存在于骨髓基质中的多能成体干细胞，大量研究证明BMSCs不仅具有良好的成骨细胞分化潜能和高成骨活性，还可分化成为软骨细胞、脂肪细胞等多种间叶组织细胞。另外BMSCs具有获取方便，易于体外纯化扩增，易于基因修饰，不存在免疫排斥问题等优点。因此，BMSCs是目前骨组织工程的最佳种子细胞[1]。骨坏死的病理转归中，血液供应的中断是最终引起临床改变的决定因素。清除坏死病灶并尽可能重建血供是治疗骨坏死的重要手段。在缺血坏死区，当病灶清除后，骨修复区的血供重建则依赖于毛细血管网的新生。但由于患者从病变侵害形成至骨坏死出现均已经过长期的病程，局部的修复环境已发生了改变，缺乏利于血管形成的微环境，从而造成了患者即使充填了有效植骨材料，仍无法迅速及早期建立血供，进而影响其最终的疗效[2]。实验利用现代分子生物学、组织工程学的研究进展，针对骨坏死病理学特点：局部骨组织血供中断、BMSCs成骨分化能力减退，构建适于骨坏死治疗的骨移植替代物，提高早期骨坏死的治疗效果。在分离纯化犬BMSCs基础上，将BMSCs与纳米晶胶原基骨（nHAC）修复材料复合构建组织工程骨，为组织工程技术治疗骨坏死提供理论与实验依据，探索提高髓芯减压植骨术治疗骨坏死成功率的新途径。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 健康成年杂种犬23只，18～24月龄，体质量（17.0±0.5）kg，雌11只雄12只，来源于连云港市东海县种犬养殖场，普通环境。随机对照动物实验过程中对动物处置符合科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。 　　1.2方法 BMSCs与纳米骨复合体的制备：取实验杂种犬骨髓分离培养BMSCs。nHAC在PBS中漂洗30min共3次，在95%的乙醇中浸泡2h，用无菌滤纸吸去多余液体。取第3代BMSCs长满后，消化细胞并将细胞配成2×109/L细胞悬液，D-Hanks液冲洗后，用2.5 g/L的胰酶+0.01%的EDTA消化，吹打后离心，以1500r/min转速离心10min，去上清，加入少量培养液，振荡后计数，制成浓度为1×109/L的细胞悬液。将材料放于96孔板内，1粒/孔，复合于2.5mm×2.5mm×2.5mm纳米骨上。每孔接种上述细胞悬液200μL进行BMSCs与nHAC的复合培养，37℃体积分数为5%CO2恒温培养箱继续培养，2～3d换液1次，备用[3]。 　　1.3动物分组 取造模成功后的股骨头坏死模型犬23只（骨膜部分剥离+髓腔破坏法成形左、右后肢股骨头坏死模型），随机分为空白组11只、单纯纳米骨植入组11只、纳米骨+BMSCs复合体植入组11只。造模及治疗方法：术区备皮后以30g/L戊巴比妥钠麻醉，取俯卧位，常规消毒、铺巾，髋关节后侧切口，从臀大肌与阔筋膜张肌之间进入，切断外旋肌群，暴露关节囊，外旋股骨，显露股骨头，不切断圆韧带，髋关节不脱位，保护周围组织，从股骨颈内后侧向股