遗传学13第十二章遗传工程详解.ppt

2、T-DNA标签克隆基因 利用T-DNA插入突变 创造突变体，获取目 标基因或克隆 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA 利用侧翼DNA序列作探针从cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的 野生基因转化突变体，回复功能） 图12-12 T-DNA标签克隆基因的基本原理 3、基于PCR的基因克隆 PCR可在数小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝，可代替一些经载体克隆基因的方法。其原理是根据待扩增基因的序列合成引物，使两个引物序列之间的基因序列获得大量扩增，产生大量的基因拷贝用于研究 4、基因的人工合成 对于已知核苷酸序列、分子量较小的基因可以通过化学合成法制备基因。一般先一段一段地合成，然后将这些小片段连接起来。人工合成基因可以由DNA自动合成仪来完成 四、重组DNA分子 第三节 外源基因的导入 一、农杆菌介导的遗传转化 1、根癌农杆菌(Ti质粒) 2、发根农杆菌(Ri质粒) 发根农杆菌侵染后植物细胞产生许多不定根，这种不定根生长迅速，不断分枝成毛状，故称之为毛状根(发状根) Ri质粒的结构与Ti质粒的结构很相似，可以分为T区、vir区、ori区和其它区域等几个部分。 T区与Ti质粒的T-DNA十分相似，包括①T区的左右边界序列;②TL-DNA区;③TR-DNA区。 图12-15 棉花转基因植株生产过程 F 1. 共培养 2. 在选择培养基上筛选 3. 筛选获得的抗性愈伤 5. 胚萌发成苗 6. 转基因植株移栽大田 4. 抗性愈伤分化成胚状体 * 第十二章 遗传工程 第一节 遗传工程概述 遗传工程广义：细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程 酶工程、发酵工程 狭义：基因工程 基因工程概述 基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。 →1982年经美国食品及药物管理局批准 ，采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场，成为基因 工程产品直接造福于人类的首例 →1985年转基因植物获得成功 →1996年克隆羊诞生。 →现在，人类已利用这一技术改造和创 建新的生命形态、生产药品、疫苗、 牛奶和食品，诊断和治疗遗传疾病。 基因工程的基本步骤： 1.目的基因的分离或合成 2.将目的基因与载体DNA连接，构建重组DNA分 子-表达载体 3.将重组DNA分子导入受体细胞，并获得具有外 源基因的个体 4.转基因生物的检测与鉴定 5.转基因生物的安全性评价 第二节 基因的分离 基因分离（克隆）包括3个步骤： 1. 目标DNA片段（基因）的分离 2. 目标基因克隆到载体上 3. 载体导入宿主细胞并在其中大量 复制 一、工具酶 1、限制性内切核酸酶 限制酶：作用于特定（异）核苷酸序列 的磷酸二脂酶 Ⅰ型酶：仅EcoB和EcoK两种，催化限制 性切割和修饰核苷酸2种功能 Ⅱ型酶：遗传工程中应用最广泛 Ⅲ型酶：具有特异的识别位点，识别位 点是非对称的 Ⅱ型限制性酶的基本特性： ① 有特异识别和切割的序列部位 ② DNA分子上两个单链断裂的部位通 常不是直接相对的 ③ 断裂所形成的DNA片段常具有碱基 互补的单链尾巴（粘性末端） ④ 内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成，即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的 限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接 回纹序列 图12-1通过用相同的限制性内切酶切割 形成一个重组DNA分子 限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点 平齐末端 2、DNA连接酶 DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3’ –OH和5’ – 磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来 3、反转录酶 反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶 通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNA library） 4、聚合酶链式反应(PCR) PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明, 1993年诺贝尔化学奖 PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝 PCR反应在一种混合液中进