第二章-2 基因克隆载体-9.9课件.ppt

二、基因克隆载体 质粒空间构型与电泳速率： 质粒的分类 接合型质粒 质粒的改造与构建： T4噬菌体 M13噬菌体 M13的生活周期 Cosmid克隆的过程 1）双链质粒复制模式 2）单链噬菌体滚环复制模式 3）噬菌粒载体的包装 高效复制的噬菌粒单链DNA被包装成噬菌体颗粒，被挤出宿主细胞外。 表示M13辅助噬菌体DNA 空载体?-DNA产生蓝色透明斑； 颜色反应类标记：lacZ lacZ基因编码?-半乳糖苷酶，在IPTG诱导下，能催化无色底物X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入lacZ中，基因灭活，不能生成蓝色化合物。 4、构建琥珀型突变体 是指CAG(Gln)向UAG(stop)的突变。 琥珀型突变(sup)： E.coli的某些菌株含特异性校正基因，其编码产物--校正tRNA能专一性纠正这一突变。 基因工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 将野生型?-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。 当这种?-DNA进入一般E.coli后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，从而阻止有害重组体的生物污染及扩散。 重组?-DNA需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 重组?-DNA的体外包装 用于体外包装的蛋白可直接从感染?噬菌体的E.coli中提取，已商品化，通常为互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分缺少D组份。 ---这是基于安全性而设计的。 任何一种蛋白包装液被重组?-DNA污染，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。 包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组?-DNA分子混合后，包装才能有效进行。 ?-DNA的分离纯化 将E.coli在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入?-噬菌体悬浮液，37℃培养1hr 用新鲜培养基稀释，继续培养4-12hr （噬菌体颗粒密度达1013-1014/L，E.coli完全裂解） 超速离心，沉淀噬菌体 酚抽提，释放?-DNA 乙醇或异丙醇沉淀?-DNA ?-DNA作为载体的特点： 可在体外包装成噬菌体颗粒，高效感染E.coli； 装载容量大，最大25 kb； 筛选方便； 提取比质粒简便； 适合外源基因的克隆和扩增，但不适合其表达。 E.coli的M13单链噬菌体DNA 生物结构： 外型呈丝状； 由外壳包装蛋白和单股正链DNA组成； 基因组为单链线性DNA，长6.4 kb； DNA上至少有10个基因，均为增殖所必需。 2,700个外壳蛋白 不裂解宿主细胞，但抑制其生长； 注意：虽不导致溶菌，但使菌斑混浊（细菌生长变慢，为正常的1/2-3/4）。 组装成新的噬菌体M13，挤出寄主细胞 M13通过雄性细菌的F性须注入其+DNA +DNA合成-DNA，形成双链RF DNA 复制+DNA，转录mRNA、翻译形成噬菌体蛋白 +DNA +DNA 注入E.coli +DNA 指导合成 M13外壳蛋白 转录 翻译 mRNA 复制 +DNA 200个RF DNA - DNA （每个细胞可释放约1000个M13颗粒） 组装成子代M13 M13基因组中只有基因II和IV之间存在一段507bp的基因间隔区(intergenic region, IG区)。 该区存在M13的ori，插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力，可作为克隆区。 M13 DNA载体的构建： III VI I IV II X V VII IX VIII 野生型M13 RF-DNA III VI I IV II X V VII IX VIII M13 mp系列载体 lacZ’ polylinker IG IG区内只有1个Bsu I 切点 M13mp18的多克隆位点与pUC18相同 M13 DNA载体的特点： 克隆的DNA以单链形式输出E.coli，便于测序； M13重组子筛选简便； 最大缺陷是装载量小，仅1.5 kb。 被M13感染的受体菌生长缓慢，形成混浊斑；重组DNA越大，混浊斑的混浊度越大。 动植物病毒DNA 单链DNA病毒 双链DNA病毒 单链RNA病毒 双链RNA病毒 按基因组结构，将动植物病毒分成四类： 动植物病毒克隆载体 双链DNA病毒：如花椰菜花叶病毒(CaMV) 单链DNA病毒