由MDS进展为急性白血病患者线粒体DNA D—loop区的突变.docVIP

由MDS进展为急性白血病患者线粒体DNA D—loop区的突变 　　[摘要] 目的：研究4例由骨髓增生异常综合征（MDS）进展为急性白血病的患者骨髓线粒体DNA D-loop区的突变。方法：提取4例由MDS进展的白血病患者骨髓以及口腔上皮组织的线粒体DNA，对线粒体DNA D-loop区两个高变区（HV1和HV2）进行PCR扩增，通过直接测序的方法对PCR产物的基因序列进行检测。结果：在4例急性白血病患者骨髓标本中有3例检测到突变，突变位点共4个，计算突变率为：75%，突变类型为碱基置换突变和碱基缺失。结论：在由MDS进展的白血病患者中检测到D-loop区的突变，可能与MDS的疾病进展有关。 　　[关键词] 骨髓增生异常综合征；白血病；DNA，线粒体；突变；单核苷酸多态性 　　骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome， MDS）是一组起源于造血干/祖细胞的克隆性疾病，以高风险进展为白血病为特征。细胞遗传学的异常在MDS患者中多见且与疾病的预后及向白血病的转化有关。近年来在很多实体恶性肿瘤的研究中发现存在高频率的人类线粒体DNA（mitochondrial DNA， mtDNA）突变，这些突变主要集中在线粒体DNA的非编码区，即 D-loop区[1-2]。本研究对MDS进展的白血病患者线粒体D-loop区的HV1区和HV2区进行PCR扩增，并通过直接测序法对基因序列进行检测，从而探讨mtDNA突变在MDS发生发展中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 研究对象 由MDS进展为急性白血病患者4例，其中男2例，女2例，年龄54～62岁，骨髓样本来自2011年10月至2012年4月山东大学齐鲁医院桓台分院住院患者。 　　1.2 仪器与试剂 PCR仪为德国eppendorf公司产品，TaqDNA聚合酶购自上海博亚生物技术有限公司，口腔试子基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收纯化试剂盒购自北京天根公司。纯化后的PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。 　　1.3 方法 　　1.3.1 基因组DNA的提取 收取患者骨髓标本2～3mL，3.8%枸橼酸钠抗凝，同时收取患者口腔上皮细胞。酚-氯仿法抽提骨髓基因组DNA，三甲基氯基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）溶解DNA，-80℃保存备用。口腔试子基因组DNA提取试剂盒提取取口腔上皮基因组DNA。 　　1.3.2 聚合酶链反应扩增线粒体DNA 引物序列设计如下：HV1区上游引物：5’-TAACTCCACCATTAGCACC-3’，下游引物：5’-ATTGATTTCACGGAGGATG-3’，扩增片段长度468bp；HV2区上游引物：5’-CGACATCTGGTTCCTACTTC-3’，下游引物：5’-GAAATCTGGTTAGGCTGGTG-3’，扩增片段长度488bp。 　　50μL的PCR反应体系中包含1μL的mtDNA模版，0.1μmol/L dNTP，1.0 U TaqDNA聚合酶，2.0mmol/LMgCl2，10×PCR缓冲液5μL，引物0.2μmol/L。循环参数：95℃ 5min，随后35个循环为：94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，最后72℃延伸7min。反应结束后，从50μL反应体系中取5μL在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙啶（EB）染色，紫外灯下观察电泳图像并确认所测片段是否成功扩增。 　　1.4 DNA序列测定 证实PCR产物成功扩增后，将剩余的PCR产物纯化后进行测序。将所测线粒体DNA D-loop区的HV1区和HV2区基因序列与剑桥标准序列（revised Cambridge reference sequence，rCRS）进行对比。在骨髓标本中与剑桥序列不一致的位点再与同一患者的口腔上皮正常组织的序列比较，若此位点的变化在口腔上皮组织中未出现，则定义为突变。 　　2 结 果 　　2.1 mtDNA 测序结果 见图1，图2。在4例骨髓增生异常综合征进展的白血病患者骨髓标本中共有3例患者检测到突变，突变位点共4个，计算突变率为75%。突变类型为碱基置换突变和碱基缺失。 　　3 讨 论 　　线粒体DNA由于缺乏组蛋白的保护，裸露于氧化磷酸化的环境中，而且在复制过程中缺乏必要的修复机制，故易受致癌物、氧自由基等的损伤，使其突变率是核DNA的10倍以上[3]，其中D-loop区占全部mtDNA的6%左右，位置在16 028～577 bp，富含A-T碱基。mtDNA重链和轻链的转录启动子以及重链的复制起始位点均位于此区域内，因此，如果突变发生在D - Loop区，将引起整个线粒体功能的紊乱，直接影响线粒体的功能。多项研究表明，D-loop区的突变具有积累效应，有随年龄增长而增加的