4种牙科金属材料对成纤维细胞L929凋亡相关基因及蛋白表达的影响.docVIP

4种牙科金属材料对成纤维细胞L929凋亡相关基因及蛋白表达的影响 　　[摘要] 目的 研究4种不同牙科金属材料（金合金、银钯合金、钴铬合金、镍铬合金）浸提液对小鼠成纤维细胞 　　L929凋亡相关基因及蛋白表达的影响。方法 以金合金（A组）、银钯合金（B组）、钴铬合金（C组）、镍铬合金（D组）的浸提液体外培养小鼠成纤维细胞L929，并以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基作为阴性对照（E组）。采用逆转 　　录聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测了4种牙科金属材料浸提液对L929细胞凋亡相关基因caspase-3、8、9 mRNA和蛋白表达的影响。结果 4种牙科金属材料浸提液培养小鼠L929细胞48 h后，除A组与E组间差异无统计学意义外，各组间caspase-3 mRNA及caspase-9 mRNA表达差异有统计学意义（P0.05）。各组间caspase-8 mRNA差异无统计学意义。除A组与C组、B组与D组间差异无统计学意义外，caspase-3及caspase-9蛋白表达差异有统计学意义，各组间caspase-8蛋白差异无统计学意义。结论 4种牙科金属材料，除金合金外，均诱导小鼠成纤维细胞L929凋亡相关基因表达增加，金属离子可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡。 　　[关键词] 牙科金属； 浸提液； 成纤维细胞L929； 凋亡； 免疫组织化学 　　[中图分类号] R 783.1 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.007 　　目前牙科合金材料的的强度、硬度、韧性和耐磨性等力学性能比较优越，已经成为口腔临床中重要的修复材料。按照组成合金主要元素的价值可以分为贵金属合金和非贵金属合金两大类[1-2]。应用于口腔中的贵金属合金（如金合金等）和非贵金属合金（如镍铬合金等）在细胞水平上均显示出良好的生物相容性。然而，口腔环境复杂且金属修复体在口腔环境中行使功能是一个长期的过程，口腔微生物可以通过多种途径对材料产生腐蚀[3]。材料腐蚀可引起金属离子释放，如释放的金属离子达到一定的浓度后可能会导致局部或全身的损害[4]。有研究显示金合 　　金离子析出量相对较少，耐腐蚀性能相对较好；而镍铬合金的耐腐蚀性能尚不够理想，镍离子可以改变牙龈成纤维细胞的形态、生存和增殖能力[5-6]。因此，生物相容性在义齿的材料选择中将越来越受到重视。从整体、细胞和分子水平上评价材料的生物相容性是生物材料评价的发展趋势和最终目的[7]。 　　本研究应用逆转录聚合酶链反应（reverse trans-cription-polymerase chain reaction，RT-PCR）及免疫组化的方法在分子水平上对4种牙科合金（金合金、银钯合金、钴铬合金、镍铬合金）材料浸提液培养48 h的L929细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（cas- 　　pase）-3、8、9 mRNA及蛋白表达进行检测，在分子水平上探讨金属离子与细胞凋亡的关系。 　　1 材料和方法 　　1.1 细胞株 　　小鼠成纤维细胞L929由中国医科大学中心实验室提供。 　　1.2 试剂和仪器 　　RPMI1640培养基（Gibco公司，美国），胎牛血清（TBD公司，天津），RT-PCR试剂盒（TAKARA公司，日本），总RNA提取剂（杭州博日公司），二甲基亚砜 　　（AMRESCO公司，美国），兔抗鼠caspase-3多克隆抗 　　体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（北京博奥森公 　　司），免疫组化试剂盒（PV6001，北京中杉金桥有限 　　公司），细胞培养箱（HERA Cell 150，Heraeu公司， 　　德国），高速离心机（DUPONT公司，美国），倒置相 　　差显微镜（Olympus公司，日本），恒温水浴锅（Grant 　　公司，英国），聚合酶链反应（polymerase chain reac- 　　tion，PCR）仪（Biometra公司，德国），电泳仪（北京市六一仪器厂）。 　　1.3 实验分组及浸提液制备 　　将实验材料分为金合金（A组）、银钯合金（B组）、钴铬合金（C组）、镍铬合金（D组）4个实验组，每组样 　　本量均为8个。4种牙科合金的组成见表1。制作半径为5 mm、厚为1 mm的圆形蜡片，根据不同合金的要求铸造形成圆形金属片，打磨抛光后超声清洗15 min， 　　去离子水冲洗数遍后置于玻璃小瓶中，将金属片于121 ℃高压灭菌后置于24孔板中。每孔加2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，同时设立阴性对照组（E组，即2 mL含10%胎牛血清的RPMI1640培养液），在37 ℃、5%CO2条件下连续浸提7 d后待用[8]。 　　1.4 RT-PCR检测caspase-3