微弧氧化钛表面对成骨细胞形态及细胞骨架的影响.docVIP

微弧氧化钛表面对成骨细胞形态及细胞骨架的影响 　　[摘要] 目的 研究微弧氧化钛表面对成骨细胞形态及细胞骨架的影响。方法 将直径15 mm、厚度1 mm的纯钛片根据表面处理方法不同分为4组：机械打磨（G）组、喷砂（SB）组、打磨微弧氧化（GMAO）组和喷砂微弧氧化（SBMAO）组。采用扫描电子显微镜（SEM）、激光共聚焦显微镜（LSCM）研究钛片表面成骨细胞生长情况及细胞骨架的改变。结果 成骨细胞接种12 h后，各组细胞均沿钛片表面铺展开，且GMAO组和SBMAO组细胞覆盖于火山口状微孔上。各组肌动蛋白纤维清晰可见，GMAO组和SBMAO组肌动蛋白纤维平行排列，汇聚成束伸向微孔内。结论 微弧氧化后的钛表面可以影响成骨细胞铺展的形态及细胞骨架的排列。 　　[关键词] 微弧氧化； 激光共聚焦显微镜； 成骨细胞； 细胞骨架 　　[中图分类号] R 783.2 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.006 　　种植体成功的关键在于形成良好的骨结合，而成骨细胞是骨结合的关键。种植体植入后，成骨细胞首先在种植体表面黏附、丛集，然后分泌骨基质，启动新骨生成。新骨从种植体表面逐渐向骨创面生长、延伸，最终形成种植体与骨组织的骨结合。由此可见，提高成骨细胞的成骨活性是提高种植成功率的有效途径。目前种植体表面改性的主要方法有表面形貌改性、表面化学成分改性及表面功能涂层改性。微弧氧化是目前研究中的热点。有研究[1-3]报道，微弧氧化表面对成骨细胞的黏附、增殖、分化均有促进作用。本实验在打磨和喷砂基础上，采用微弧氧化法处理钛片，研究微弧氧化钛表面对成骨细胞形态及细胞骨架（cytoskeleton，CSK）的影响。 　　1 材料和方法 　　1.1 钛片的表面处理和分组 　　将直径为15 mm、厚度为1 mm的钛片，按处理方法不同分为4组：机械打磨（G）组、喷砂（SB）组、打磨微弧氧化（GMAO）组和喷砂微弧氧化（SBMAO）组。 　　G组采用机械打磨方法，依次用防水砂纸240、360、600、800目同向打磨钛片，使表面光滑，呈金属光泽，肉眼观划痕一致。SB组在机械打磨的基础上，使用40～60目的二氧化钛砂在6.5 kPa、10 cm距离条件下均匀喷砂。GMAO组为将经过机械打磨的钛片用丙酮在超声波清洗机中清洗，干燥后进行微弧氧化。微弧氧化电解液的基本组成成分为20 g·L-1 Ca（CH3COO）2·H2O、9.3 g·L-1 Na5P3O10和Na2SiO3·9H2O，去离子水为溶剂，试剂均为分析纯。将钛片作为阳极，不锈钢电解槽为阴极进行微弧氧化。实验所用的电参数为：正向电压350 V，负向电压160 V，频率800 Hz，处理时间20 min，电解液通过冷却水循环系统进行冷却，微弧氧化过程中温度控制为15～ 　　30 ℃。SBMAO组为将经过40～60目喷砂的钛片用丙酮在超声波清洗机中清洗，干燥后进行微弧氧化。 　　1.2 成骨细胞的体外培养 　　采用改进后的贴壁组织块分步消化法体外培养成骨细胞。 　　1.3 钛片表面成骨细胞的形态变化 　　取生长至第3代的成骨细胞，无菌PBS冲洗后0.25%胰酶消化，吹打均匀后调整细胞密度至每毫升4×104个，用加样器吸取500 ?L细胞悬液接种于放有预置清洁钛片的24孔板内，每组3枚钛片。当分别培养至2、4、12 h后弃去培养液，PBS冲洗，室温加入4%多聚甲醛固定10 min，乙醇梯度脱水（体积分数分别为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，前6种体积分数每种脱水2次，每次3 min，100%体积分数脱水3次，每次3 min），真空干燥，喷金，扫描电子显微镜（scanning electron micro-scope，SEM）观察成骨细胞形态并拍照。 　　1.4 钛片表面成骨细胞内CSK的变化 　　将接种好成骨细胞的各组钛片进行异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽（fluorescein isothiocyanate-phalloidin，FITC-phalloidin）室温染色60 min，PBS清洗细胞3次，置于激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）下观察CSK的微丝形态变化并拍照。 　　2 结果 　　2.1 钛片表面成骨细胞形态的变化 　　成骨细胞接种于钛片表面不同时间的细胞形态见图1。 　　成骨细胞接种2 h（图1第1行），与刚消化下来时的圆形细胞相比，各组细胞已经有明显的伸展，体积也有增大。G组细胞向四周伸展，无方向性，细胞边缘与钛表面结合紧密。SB组细胞有选择性地附于喷砂形成的孔洞内，细胞形态不规则，细胞足进一步伸展攀附于孔洞边缘，与钛片粗糙表面结合