菌株及质粒.docVIP

常用菌株一览表 BL21（DE3） 该菌株用于高效表达克隆于有T7噬菌体启动子的表达载体的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。天然缺失外膜蛋白酶ompT和ATP依赖的蛋白酶Lon（La），利于异源蛋白的表达。在培养皿上的生长时间约为10小时左右。 ER2566 该菌株用于高效表达克隆于有T7噬菌体启动子的表达载体的基因。在培养皿上的生长时间约为10小时左右。 DH5α 一种用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷的抑制型菌株。其 80lacZΔM15基因的产物可与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，即可以用于蓝白斑显示。该菌株也缺失多种蛋白酶，在培养皿上的生长时间约为12小时左右。 JM101 一种可支持带有琥珀突变的载体生长的宿主菌，在培养皿上的生长时间约为10小时左右。 JM109 一种带有琥珀突变的载体生长的重组缺陷的抑制型菌株，对转染的DNA有修饰作用但无限制作用，在培养皿上的生长时间约为10小时左右。 HB101 一种通常用于大规模制备质粒的抑制型菌株，它是一种转化效率很高的大肠杆菌K12×大肠杆菌B的杂交菌株，在培养皿上的生长时间约为10小时左右。 常用原核表达质粒一览表 质粒 名称 实验室 系列数 启动子 大小 (Kb) 抗性 标记 融合蛋白 大小(kD) 诱导物 pRSET 3 T7 2.9 Ap 3-5 kD IPTG p24B11 1 T7 5.4 Kan 0-1 kD IPTG pTYB 4 T7 7.3 Ap 55 kD IPTG pGEX 6 Ptac 4.9 Ap 26 kD IPTG pET 2 T7 4.7 Kan 3-4 kD IPTG pTRX-Fus 1 PL 3.5 Ap 11 kD Trp pBV 2 PL / Ap / 420C pMAL 2 Ptac 6.7 Ap 43 kD IPTG 如何提高目的蛋白在大肠杆菌中的表达量及可溶性表达？如何防止目的蛋白的降解？ 融合蛋白的表达水平主要受目的蛋白影响、密码子不适、疏水性强、mRNA降解、或由于蛋白错误折叠而水解都可能造成表达水平低，可尝试不同的生长和表达条件来提高融合蛋白的表达量，低温诱导可降低包含体的形成及避免水解；运用最适密码子可提高表达；也可能由于目的蛋白对宿主细胞有毒性而使克隆不稳定。故表达时可利用丰富的培养基、新鲜的单菌落、低温诱导、低浓度的IPTG、减少诱导时间等条件来提高蛋白及可溶性蛋白的产量。蛋白酶抑制剂，蛋白酶缺陷的工程菌或者低温诱导可防止目的蛋白降解，纯化时为防止降解可使用变性条件，如6M脲等。 pMAL纯化系统 pMAL-p2为分泌型表达载体， 表达的融合蛋白分布于大肠杆菌外周腔，用冷渗透法即可获得较纯的融合蛋白。pMAL-c2表达的可溶性融合蛋白多位于大肠杆菌细胞质中，可按常规方法进行纯化。 二者均为Ptac启动子，大小约为6.7Kb， 唯一不同的是pMAL-c2 无malE 信号序列。MBP的分子量为43KD。介质――amylose resin，与麦芽糖的结合能力大于3mg/ml。 pMAL-p2的纯化 用1L的培养基表达目的蛋白， 离心后用400ml的30mM Tris-HCl， 1mM EDTA， 20%蔗糖pH8.0的缓冲液悬浮， 室温下轻轻摇动5-10min。 4℃，8000g离心20min，弃去上清，加入400ml冰预冷的含5 mM MgSO4柱缓冲液悬浮，冰浴摇动10min。 4℃，8000g离心20min，上清即为冷渗透的溶液。 在上清中加入8ml的1M Tris-HCl (pH7.4)。 用8倍体积的柱缓冲液平衡介质。 上样， 结合30min。 用12倍体积的柱缓冲液平衡介质 用3ml的洗脱缓冲液(含10mM的麦芽糖的柱缓冲液)洗涤多次(10-20次)， 一般情况下目的蛋白集中在前5个收集峰中。 pMAL-c2的纯化 用1L的培养基表达目的蛋白， 离心后用40ml的柱缓冲液悬浮。 超声处理样品， 离心后收集上清。 以下方法按pMAL-p2的步骤5--8进行。 所需培养基及缓冲液 ①丰富培养基 每升中含10g tryptone 5g yeast extract 5g NaCl 2g glucose ②colume buffer: 20mM Tris-HCl ( pH7.4 ) 200mM NaCl 1 mM EDTA ③elution buffer: col