抗体药物偶联物的制备研究__培训课件.ppt

Company Logo LOGO 抗体药物偶联物的制备研究 班级： 学生： 学号： 河北科技大学本科论文答辩 目录 实验分以下几项进行介绍 3.实验结果与讨论 1.引言 2.实验部部分 4.实验结论 1.1课题背景 本课题是对抗体药物偶联物的制备进行研宄，主要内容如下： 从众多检测蛋白的方法中挑选出适用于检测抗体还原后产物的最优方法。采用常用的还原剂对抗体进行还原，检测抗体不同时间下还原程度，得出最优还原反应时间以及还原过程的动态变化。 对反应温度，反应pH，还原剂与抗体的还原比例进行响应面试验设计，优化反应条件，从常用的九种还原剂中筛选出高效的还原剂，用来连接带有马来酰亚胺接头的药物，进行抗体药物偶联物制备实验。 2.1实验机理 抗体被还原到合适的程度后，进行与药物的偶联反应，通常在pH 7?8左右，反应温度0°C下反应1h。例如如果抗体被还原到4巯基/抗体，通常加入4-5倍的马来酰亚胺接头的药物反应30min[1]。其中采用二甲基甲酰胺（DMF)或者二甲基乙酰胺（DMAC)先将药物溶解，然后与抗体还原后的产物反应[2，3]。加入过量的小分子硫醇进行猝灭，来阻止马来酰亚胺与抗体上的巯基进一步反应，药物接头的马来酰亚胺被猝灭后，接下来的步骤就是要除去多余的药物接头以及有机溶剂，EDTA等添加物。 由于药物的成分、均一性与药物的安全以及药物的疗效息息相关，因此对抗体药物偶联物的组成、非均一性分析越来越被重视[4] 。疏水色谱柱TSKgelButyl -NPR (4.6mm X 3.5 cm)以对蛋白的高速、高分辨率的分离性能为广大研宄人员提供了帮助。它以表面键合有丁基的、粒径为2.5—的非多孔型亲水性树脂作为填充剂。 2.2实验方案 ◆分别取浓度为26.6mg/mL的IgG 75pL分装至离心管中，TCEP和DTT用PB7.0缓冲液配置成10mM溶液，然后稀释至1mM，将药物溶于N, N-二甲基甲酰胺配成浓度为2 mM的溶液。 ◆还原反应：将还原剂按表中比例加入到IgG溶液中，补充缓冲液至总体积为150pL，用移液枪吹打混匀，将反应体系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应2h。SDS检测是否被还原。 ◆在反应体系中取出5pL稀释至20pL，加入非还原电泳上样缓冲液，进行SDS，检测还原反应程度[5] 。 ◆采用3K超滤管超滤膜在4000g转速下离心至少5次，以除去未反应还原剂。同时将整个反应置换成Tris-HCl 8.0的缓冲体系中。 ◆加入不同比例2mM药物142B1，Drug：IgG比例分别为4、5、6。比例和体积如表中所示，加入Tris-HCl pH8.0至反应体系为200pL (表4-3)。采用混匀器混匀后，将反应体系放置到37C恒温摇床中，180转速下反应1h。 ◆向最终的反应体系中加入半胱氨酸，使其中浓度达到1mM，猝灭未反应 的药物。反应后的样品采用BCA法检测浓度。 实验药品及其规格 2.3实验药品和仪器 2.4.1、蛋白浓度测定 蛋白浓度采用BCA方法测定。具体步骤为：分别在96孔板的每个孔中加入20pL 不同浓度（0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL 和 1.0mg/mL)的蛋白标准品(BSA标准溶液2mg/mL)和待测样品和空白对照，然后加入200pL工作液（A液:B液=50:1)，将96孔板放置于37C的恒温培养箱中反应0.5h。将酶标仪的检测波长设为562nm，在该波长下检测每个孔中蛋白质的吸光值。然后根据标准蛋白的浓度和测出的吸光值，绘制蛋白质浓度标准曲线。从标准曲线计算得到检测样品的浓度。 ◆SDS是依据通过SDS使蛋白质分子带上大量负电荷中和蛋白质分子本身电荷，消除蛋白质分子本身的电荷效应。依据蛋白质的分子大小呈现不同条带。通过凝胶成像系统所得图片蛋白带的宽度以及颜色的深浅，采用光密度分析可以判断出蛋白带大约的蛋白量。 ◆采用非还原的SDS电泳，浓缩胶为8%的聚丙烯酰胺凝胶，分离胶为12%的聚丙烯酰胺凝胶。样品缓冲液中不含巯基乙醇[6] 。取20pL(0.1mg/mL?0.5mg/mL)蛋白样品加适量的样品缓冲液在100C下煮沸5min， 8000g高速离心5min后上样。考马斯亮蓝染色，染色剂为考马斯亮蓝R-250。 2.4.2、聚丙烯酰胺凝胶电泳 2.4.3、疏水作用层析 ◆层析前样品处理：采用BCA法检测抗体与药物偶联后产物的浓度，将产物用PBS稀释到1mg/mL[7] 。采用0.22pm的超滤膜过滤，除去样品中杂质。 ◆采用分析柱TOSOH TSKgel Butyl-NPR检测抗体与药物偶联后的各个产物的生成情况，液相系统为AKTA Explorer 100。 ◆分析条件：流动相为 Buffer A: 1.5M (NH4)2S