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酵母双杂交学生：qxcr专业：@@@@学号：*************酵母的特性酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）真核生物的大肠杆菌基因组小有典型的真核生物的转录后修饰过程一个酵母可同时兼容几个不同质粒（带有2μm复制子）酵母双杂交系统Yeast two-hybrid system 1989年Field 和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。以真核细胞转录激活因子的结构和活性特点为基础的。转录激活因子GAL4的特点N端含有核定位序列（NLS）和与酵母GAL1基因启动子上游激活序列(UAS)相结合的DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD)C端含转录激活结构域 (activating domain, AD)功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性 GAL4激活转录过程GAL4转录激活因子基因转录翻译GAL4Activating domain转录激活结构域DNA binding domain结合结构域ADDBD激活转录GeneADDBDUAS上游激活序列激活转录ADDBD设计思路是否相互作用？蛋白构建DBDXADYDBD-X融合蛋白AD-Y融合蛋白XXXDBDDBDADADAD报告基因产物YYYY表达激活转录构建UAS上游激活序列报告基因即：DBD-X为诱饵蛋白，AD-Y为猎物蛋白一般步骤1.改造酵母使用特定的营养缺陷型菌株例：Trp与Leu缺陷型，即酵母菌自身不能合成Trp和Leu，需要从培养基中吸收Trp和Leu。UAS上游激活序列报告基因 lacZβ-半乳糖苷酶基因2.构建载体用X的cDNA构建DBD-X穿梭表达载体用Y的cDNA构建AD-Y穿梭表达载体酵母细胞复制起始点酵母细胞复制起始点AmprAmpr2μori2μoriPromoter启动子Terminator终止子PTTRP1LEU2XADDBDYPTXXXPromoter启动子Terminator终止子DBDDBDDBD3.转化筛选ADADYY缺陷型酵母菌第一次转化第二次转化-Trp培养基筛选-Trp/-Leu培养基筛选4.检测——蓝白斑激活转录UAS上游激活序列报告基因 lacZlacZβ-半乳糖苷酶表达X-gal白色蓝色XDBDADY-Trp/-Leu培养基-Trp/-Leu/+X-gal培养基5.序列分析从酵母中分离质粒然后转化E. coli从大肠杆菌中提取质粒并测序在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性酵母双杂交系统的应用分析、验证已知蛋白之间的相互作用确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质绘制蛋白质相互作用系统图谱在药物设计中的应用酵母双杂交系统的优点根据目标蛋白的基因序列 即可筛选与其作用的目的蛋白，不需分离靶蛋白蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被检测出来，真实反应体内蛋白质间相互作用情况可以直接获得目的蛋白的基因序列，从而可以初步判断目的蛋白的结构和功能。敏感性高常见问题1.如果DBD-X对酵母细胞是有毒的，该怎么办？某些情况下，在液体培养基中培养不好的菌珠可以在固体培养基上生长得很好。首先重悬克隆于1ml的SD/–Trp，接着将重悬液平铺于5 个100-mm的SD/–Trp平板，在30℃下温浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5×YPDA刮下每块板上的克隆，并收集到一管中，这样就可以使用这个细胞重悬液进行正常的杂交反应。常见问题2.如果诱饵蛋白DBD-X能直接激活报告基因的表达，该如何处理？该蛋白很可能有转录激活域，是个转录因子。可以通过基因重组切掉转录激活域，然后重新检测其是否自激活，但要注意重组也有可能破坏蛋白之间的互作。常见问题3.转化效率太低怎么办？可以采用以下方法解决：1) 检测一下DNA的纯度，如果可以的话，重新用乙醇纯化。2) DNA-BD很可能是有毒的。3) 不适当的培养基，重新配制培养基，并做对照转化。4) 共转化或者单独转化常见问题4.杂交效率不高，该如何处理？在杂交中，预转化的诱饵细胞的数量可能不够。当对诱饵菌株进行液体培养过夜时，应挑选大的、新鲜的克隆进行培养，经过离心和重悬后，再使用血球计对细胞进行计数。密度应该在1 x 109/ml。?一个甚至两个融合蛋白对酵母细胞有毒。使用表达水平较低的载体。也可以在琼脂平板或滤膜上进行杂交。但同时必须作杂交对照实验。酵母双杂交系统的局限性表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与天然状态不符，造成结果的不准确假阳性，本身就具有转录激活活性的目标蛋白不适合于该系统并非对所有蛋白质适用，不能定位于核内的兴趣蛋白不适合于该系统需要翻译后修饰的蛋白不适合该系统酵