携Apoptin和PEG3启动子双特异性重组腺病毒的构建.docVIP

携Apoptin和PEG3启动子双特异性重组腺病毒的构建 　　腺病毒(adenovirus，Adv)是一种无囊膜的双链DNA 病毒，基因组大小约为36kb。迄今为止，已发现的人腺病毒有100多种血清型，其中用于人类肿瘤基因治疗的多为人5型腺病毒。基因治疗因可逆转肿瘤细胞表型或诱导细胞自我毁灭而备受关注，病毒疗法为其中的主要领域。 　　RAPAd.Ⅰ腺病毒载体系统可用于构建重组腺病毒，该载体缺失腺病毒基因组骨架的左臂反向末端重复区(ITR)、包装信号及早期区1基因(E1)，最大程度地降低包装过程中野生型腺病毒的污染。病毒所携带的目的基因-凋亡素是一种小分子蛋白，来源于鸡贫血病病毒，能够通过诱导凋亡特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞几乎没有杀伤作用。PEG3是一种有效的肿瘤标志物，在肿瘤的发展和DNA 损伤中高度表达，具有致瘤性和促进血管发生的作用，在肿瘤细胞中的表达量远高于正常细胞，进行性增量基因3(PFG3)启动子(progression-elevated　genes　3promoter，PEG3p)具有良好的肿瘤特异性。本研究拟利用RAPAd.Ⅰ腺病毒载体系统，结合Apoptin和PEG3p，构建具有肿瘤特异性杀伤和复制功能的双特异性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a，为进一步探讨其肿瘤生物治疗用途奠定基础。 　　材料与方法 　　1　材料 　　大肠埃希菌E.coli　DH5alpha;感受态，人胚胎肾细胞(HEK293)，人非小细胞肺癌细胞(A549)，人正常肝细胞(L02)，质粒pMT-E1a、pIRES-neo、pKS-PEG3p、pAd-Apoptin、pAd5均由本实验室保存;RNA 提取试剂盒购自宝生物(大连)公司;脂质体X-tremeGENEHP购自瑞士ROCHe公司，3-(4，5-二甲噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTS)购自美国Promega公司。 　　2　方法 　　2.1　细胞培养 　　HEK293细胞在DMEM(10%胎牛血清，100U/L青霉素，100U/L链霉素)中于37℃、5%CO2条件下培养至对数生长期，用2.5g/L胰蛋白酶消化后制备单细胞悬液，调整细胞浓度至1.5times;105个/ml，接种于六孔板(每孔2ml)，培养12h～24h后用于转染。 　　2.2　穿梭质粒构建 　　用PstⅠ和BumHⅠ双酶切质粒pMT-E1a，获得目的片段E1a，与经同样双酶切的pKS-PEG3p 连接，构建质粒pSK-PEG3p-E1a。用XbaⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pIRES-neo，获得PolyA核苷酸片段，补平后与经HindⅢ酶切并补平的pSKPEG3p-E1a连接，构建质粒pSK-PolyA-PEG3p-E1a。用BumHⅠ酶切pAd-Apoptin，补平后再用SpeⅠ酶切，回收线性化的pAd-Apoptin。用XhoⅠ酶切pSKPolyA-PEG3p-E1a，补平后再用SpeⅠ酶切，获得目的基因-PolyA-PEG3p-E1a，将其与线性化的pAd-Apoptin连接，构建质粒pacAd-PEG3p-E1a-Apoptin。 　　2.3　重组腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a的包装 　　用PacⅠ单酶切pacAd-PEG3p-E1a-Apoptin和腺病毒骨架质粒(pAd5)进行线性化处理，酶切产物用无水乙醇沉淀回收，并将线性化质粒共转染HEK293细胞，培养7～10d待病毒复制到一定程度时收集并反复冻融3次，然后重新接种HEK293细胞进行扩增，获得的病毒进行RT-PCR、Western　blot和电镜鉴定。 　　2.4　RT-PCR 检测 　　培养接种重组腺病毒的HEK293细胞至80%～90%病变时提取病毒总RNA进行反转录，然后以3mu;l　cDNA为模板，以Apoptin、E1a特异引物进行RT-PCR。PCR扩增的反应体系：12.5mu;l　2times;Mix　buffer，上、下游引物各0.3mu;l，补加双蒸水至25mu;l。反应条件：95℃3min;94℃30s，57℃30s，72℃30s，共30个循环;72℃延伸10min。 　　2.5　Western　blot检测 　　培养接种重组腺病毒的HEK293、A549细胞至80%～90%病变时收获细胞，按文献[8]的方法进行Western　blot实验，五磷体检测以山羊源多克隆抗体(5%脱脂乳1000倍稀释)为一抗，二抗为鼠抗羊IgG-HRP(PBS800倍稀释);E1a检测以兔源多克隆抗体(5%脱脂乳1　000倍稀释)为一抗，二抗为羊抗兔IgG-HRP(PBS800