携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建研究.docVIP

携带人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的构建研究 　　卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)在人类生殖过程中发挥着重要作用，是促进和维持正常的性腺发育和生殖功能的重要激素，其生理功能是通过与卵巢颗粒细胞膜表面的特异性受体即卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormonereceptor，FSHR)的结合来发挥的。FSHR 是一种跨膜糖蛋白，属于G 蛋白偶联受体超家族中的糖蛋白亚家族成员。人的FSHR 由695 个氨基酸组成，其中氨基端17 个氨基酸为疏水性信号肽，紧接着是FSHR 的胞外区由349 个氨基酸构成，其后是264 个氨基酸构成的跨膜区，胞内区是65 个氨基酸组成的羧基末端。以往对FSHR 与肿瘤关系的研究主要集中于卵巢癌，但是最新研究发现FSHR 除了在卵巢癌中表达，在其他多种实体瘤血管内皮细胞中也都有表达，但是在邻近的正常组织中不表达，推测FSH 与其受体FSHR 可能通过不同信号途径参与促进肿瘤血管形成作用。初步研究表明FSHR 有可能作为潜在的肿瘤治疗靶点和肿瘤诊断以及愈后分子标志物。因此，制备基于FSHR 靶点的抗体对肿瘤的诊断以及治疗都有重要的意义。 　　本研究中采用的慢病毒表达载体是以人类免疫缺陷I 型病毒(HIV-1)为基础发展起来的基因治疗载体。它具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性大基因片段、基因导入效率及表达水平高等优点，慢病毒载体介导的转基因的表达能持续数月，从而达到良好的基因治疗效果。本实验构建了携带人卵泡刺激素受体胞外区的慢病毒载体疫苗，将包装出的携带卵泡刺激素受体胞外区的慢病毒颗粒单次免疫小鼠研究其体液免疫效应，旨在为进一步研究靶向人卵泡刺激素受体的慢病毒载体疫苗的抗肿瘤机制和效果奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 实验材料 pCMV-SPORT6-FSHR 质粒购自长沙赢润生物技术有限公司;质粒Lenti-EGFP、pCMV-dR8.91、pCMV-VSVG 购自上海斯丹赛生物技术有限公司;大肠杆菌菌株DH5alpha; 和293T 细胞为新疆生物资源基因工程重点实验室提供;6-8 周BALB/c 小鼠，购买于新疆医科大学。 　　1.1.2 工具酶和主要试剂 Pfx 聚合酶为Invitrogen公司产品;T4 连接酶、各种限制性内切酶和逆转录酶为Fermentas 公司产品;质粒小提试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、DNA 胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;兔抗FSHR 多克隆抗体为上海江莱生物科技有限公司产品;抗beta;-actin 鼠单克隆抗体、羊抗兔HRP-IgG 单克隆抗体、羊抗鼠HRP-IgG单克隆抗体为北京康为世纪生物科技有限公司产品;Opti-MEM 培养基、DMEM 培养基和胎牛血清购自GIBCO 公司。脂质体转染试剂为Promega 公司产品;polybrene 为Sigma 公司产品;其他试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方法 　　1.2.1 FSHR 胞外区的扩增以pCMV-SPORT6-FSHR 质粒作为PCR 扩增FSHR 胞外区基因序列的模板，根据FSHR 胞外区基因序列设计引物：P1 ：5#39;-GGCCTGATCAGCCACCATGGCCCTGCTCCTGGTCTC-3#39; 包含Bcl Ⅰ酶切位点，P2 ：5#39;-CCGGGCTAGCTCTGAGGATGTTGTACCCCATG-3#39; 包含酶切位点Nhe Ⅰ，此引物扩增的序列为FSHR 胞外区加信号肽的基因序列( 即FSHR 第1-366 位氨基酸， 共1 098 bp，将扩增出的片段简称为fshr366)。 　　1.2.2 基因克隆、构建及测序 用限制性内切酶BamH Ⅰ(Bcl Ⅰ的同尾酶)和Nhe Ⅰ双酶切慢载体Lenti-EGFP，切胶回收载体。用Bcl Ⅰ和Nhe Ⅰ双酶切fshr366 基因片段。回收纯化步骤参考上海生工DNA 胶回收试剂盒和PCR 产物纯化试剂盒说明书。连接产物转化DH5alpha; 感受态细胞，挑取单克隆，对PCR 以及双酶切鉴定为阳性的重组子进行测序。 　　1.2.3 重组质粒的转染及编码fshr366 的慢病毒的包装将提取的无菌处理过的重组质粒Lentifshr366/Lenti-EGFP∶pCMV-VSVG∶pCMV-dR8.91 按4∶2∶3 质量比例混于37℃预热的Opti-MEM，Opti-MEM∶三质粒总质量=50∶1(mu;L/mu;g)。充分混匀离心后将恢复到室温的fugene HD 转染试剂与三质粒总质量的比为3∶1(mu;L/mu;g)加到液面下吹打混匀。室温静置15 min 后，将混合液滴加到