携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌促血管形成的实验分析.docVIP

携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌促血管形成的实验分析 　　血管发生或新生在胚胎器官的发育、出生后创面伤口愈合及多种病理情况下都起着非常关键的作用。近年来研究表明，生长因子在细胞的增殖、迁移、损伤修复、溃疡愈合及免疫调节等方面起重要作用，已有研究表明，肝细胞生长因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)是一种多功能生物因子，具有促进血管内皮细胞增殖和新血管形成作用，还可促进组织细胞的再生、抑制细胞凋亡，可以调节炎症、促进创伤愈合。胃溃疡是一种常见消化道疾病，其病程常反复且迁延不愈，而上皮化和血管形成是胃溃疡愈合必不可少的过程，因此，本研究依据胃溃疡愈合过程原理，构建了携带HGF基因真核表达载体的减毒的沙门菌菌株(TPH)，该菌株具有以下优势和特点：①采用的是基因治疗方法，使局部转染质粒的真核细胞作为一“微型药物工厂”持续一定时间分泌表达HGF活性蛋白;②利用HGF的多功能修复作用，促血管形成;③减毒沙门菌是一良好的口服基因传递载体，对胃肠黏膜组织有亲嗜作用，有望发展成一种口服基因治疗药物;④HGF已证明可抑制瘢痕，可减少愈合后的溃疡瘢痕，可能阻止并发症的发生。从而认为该菌株可能具有促进胃溃疡愈合的作用。 　　本文旨在探讨构建的TPH的促血管形成效应，为其促进胃溃疡创面愈合机制提供实验依据。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　人胎盘cDNA文库、pSK购自美国Clontech公司;pEGFP-N1及pcDNA3为本室保存;琼脂糖、Taq酶、dNTP、限制性内切酶、T4DNA连接酶、核酸凝胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母提取物及蛋白胨购自美国Merck公司;Ty21a菌株为军事医学科学院惠赠;人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自美国模式菌种收集中心(ATCC);DMEM和胎牛血清购自美国Gibco公司;抗人HGF单克隆抗体、重组人HGF蛋白纯品购自美国Ramp;D公司;辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自美国SantaCruzBiotechnology公司;孵育第13天的鸡胚购自中国农业科学院畜牧研究所;M450甲基纤维素购自美国Sigma公司;Multiporator4308型电转仪购自德国Eppendorf公司。 　　1.2方法 　　1.2.1携带HGF基因减毒沙门菌菌株的构建 　　1.2.1.1携带人HGF基因的真核表达载体 　　pcK-HGF的构建按人HGFcDNA序列设计引物，正向引物序列为5#39;ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc3#39;，反向引物序列为5#39;tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt3#39;。从人胎盘cDNA文库克隆人HGFcDNA(约2.2kb)。并将HGF基因的PCR产物克隆至pSK载体的BamHI和SalI酶切位点中，命名为pSK-HGF。将pcDNA3载体用SspI及AvrII双酶切，回收大片段(约4.9kb)，pEGFP-N1用AvrII酶切，回收小片段(卡那霉素基因，1.1kb)，用T4DNA连接酶将回收的大小片段连接，获得卡那霉素抗性的pcDNA3载体，以避免患者青霉素过敏，命名为pcK。分别用BamHI和ApaI双酶切pcK及pSK-HGF，回收大片段及小片段，用T4DNA连接酶连接，获得携带人HGF基因的含卡那霉素抗性基因的真核表达载体，命名为pcK-HGF。 　　1.2.1.2真核表达质粒pcK-HGF电穿孔转化减毒沙门菌将减毒沙门菌Ty21a接种于LB培养液，振荡培养至对数生长中期，低温4000r/min离心收集菌体，用预冷的无菌去离子水洗涤细胞2次后重悬。用电转仪将pcK-HGF和pcK质粒各0.2mu;g转入200mu;l预处理的Ty21a。37℃轻柔振荡培养45min后涂布于含卡那霉素(100mg/L)固体LB培养基平皿继续培养，次日挑取菌落进行鉴定。 　　1.2.1.3阳性工程菌的筛选从培养板挑取单菌落分别接种于含卡那霉素LB培养液中，37℃振摇培养。转入pcK-HGF的减毒沙门菌阳性菌株的筛选通过卡那霉素抗性、PCR(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV及目的基因HGF)及提取质粒后BamHI/ApaI双酶切鉴定;转入pcK的减毒沙门菌菌株的筛选通过卡那霉素抗性及PCR筛选(利用菌液为模板，扩增真核表达启动子CMV)。CMV扩增引物：5#39;cccagtacatgaccttatggg3#39;，5#39;ggagacttggaaatccccgt3#39;。HGF扩增引物：5#39;ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc3#39;，5#39;tg