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讨论沉默β-catenin 对卵巢癌干细胞特性的影响 　　无典型早期症状，且缺乏行之有效的筛查手段，确诊时往往已为晚期，是死亡率最高的妇科肿瘤。近年来，肿瘤细胞减灭术得以不断改善，术后化疗方案不断进步，但术后复发、化疗耐药使得卵巢癌的治疗效果并无显著改善。Wnt 信号通路是一个分泌蛋白家族，对细胞的分化、迁移、极化和凋亡起到重要调节作用。beta;-catenin 被认为是经典的信号通路。beta;-catenin 信号通路被异常激活后可参与多种肿瘤形成，包括肝癌、结直肠癌、前列腺癌、胃癌、口腔鳞癌、子宫内膜癌、膀胱癌、家族性乳腺癌等。研究表明，beta;-catenin 通路对肿瘤干细胞增殖及分化有着重要的调控作用，并与肿瘤干细胞所导致的化疗耐药及复发转移密切相关。但beta;-catenin 信号通路在卵巢癌干细胞中的作用并不清楚。本研究通过沉默卵巢癌SKOV3细胞beta;-catenin 信号通路，比较它们的体内外增殖、成瘤及分化能力，为卵巢癌干细胞学说的发展提供实验依据。 　　1 材料与方法 　　1. 1 实验材料 　　人卵巢癌细胞株SKOV3( 购于中国科学院细胞库) ; 4 ～ 6 周龄BALB/c( nu /nu) 雌性裸鼠16 只( 购自北京维通利华实验动物技术公司) 体质量18 ～ 22g; DMEM 培养基、0. 25%胰蛋白酶+ 0. 04% EDTA 消化液( 购自Solarbio公司) ; RPMI 1640 培养基和B27( 购自美国Gibco 公司) ; L-谷氨酰胺、葡萄糖及胰岛素( 购自Sigma 公司) ; 人表皮生长因子( epidermal growth factor，EGF) 和人碱性成纤维生长因子( basic fibroblast growth factor，bFGF) ( 购自Peprotech 公司) ; 优级胎牛血清( 购自Gibco 公司) ; 25cm2 培养瓶、超低吸附培养皿、6 孔细胞培养板( 购自美国Corning 公司) ; 抗CD114-FITC、CD117-PE( 购自eBioscience 公司) ; beta;-catenin 抗体( 购自美国Abcam 公司) ; 小干扰RNA( 购自Invitrogen 公司) ，转染试剂lipofectamine 2000 ( 购自美国Invitrogen 公司) ; 流式细胞仪( 购自Beckman Coult ER 公司) ; 细胞培养箱( 购自Shellab 公司) 。 　　1. 2 实验方法 　　1. 2. 1 细胞培养 　　人卵巢癌SKOV3 细胞，置于完全培养基( RPMI 1640 培养基加10% 胎牛血清、100U/ml 青霉素、100U/ml 链霉素) ，于37℃、饱和湿度、5% CO2细胞培养箱无菌培养。观察细胞生长状态，取对数生长期细胞进行以下实验。 　　1. 2. 2 沉默卵巢癌 　　SKOV3 细胞中beta;-catenin 信号通路beta;-catenin siRNA 和空白对照control siRNA 通过转染试剂( 1ipofectamine 2000) 转染贴壁生长的卵巢癌SKOV3 细胞。具体操作见转染试剂说明书。转染72h 后，Westem blot 法检测细胞中beta;-catenin 表达水平。将沉默beta;-catenin 后所得细胞命名为SKOV3-RNAi，将转染空siRNA 后所得细胞命名为SKOV3-NC。 　　1. 2. 3 Western blot 法检测 　　细胞中beta;-catenin 表达将贴壁生长的SKOV3 细胞、SKOV3-RNAi 细胞及SKOV3-NC 细胞培养至对数生长期，用预冷磷酸盐缓冲液( PBS) 清洗2 次，离心收集细胞，加新鲜配制的细胞裂解液，离心收集上清，测定蛋白含量。取等量总蛋白与上样缓冲液混合，100℃、5min变性后上样，SDS电泳，转移蛋白至NC 膜。用含5mg /ml 脱脂奶粉的PBS 溶液室温封闭2h，鼠抗人beta;-catenin多克隆抗体( 1∶ 500) 4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记抗体( 1∶ 1000) 室温孵育1h，电化学发光( ECL) 检测。 　　1. 2. 4 卵巢癌 　　细胞球的培养和传代配制无血清培养基( serum-free medium，SFM) ，即在不添加血清的DMEM/F12培养基中添加葡萄糖( 6mg /ml) 、胰岛素( 2mu;g /ml) 、B27 ( 与培养液体积比1∶ 50) 、EGF( 20ng /ml) 、bFGF( 20ng /ml) 、青霉素( 100U/ml) 、链霉素( 100U/ml) 。取