谈槟榔十三味丸对抑郁模型大鼠海马和前额叶皮层AC-cAMP-PKA 信号通路的影响.docVIP

谈槟榔十三味丸对抑郁模型大鼠海马和前额叶皮层AC-cAMP-PKA 信号通路的影响 　　蒙医理论认为，“赫依”为抑郁症发病的主要病因。在临床实践中，以槟榔十三味丸(高尤-13)为代表的具有调节“赫依”功效的蒙药在抑郁症治疗中取得了较好疗效。课题组在以往的实验中观察到槟榔十三味丸对小鼠强迫游泳应激模型、利血平拮抗模型以及大鼠慢性应激抑郁模型中均呈现明显的抗抑郁作用。但其分子机制的研究尚未见报道。本研究采用慢性轻度不可预见性应激(CUMS) 结合孤养方法制备大鼠抑郁模型，测定大鼠海马和前额叶皮层腺苷酸环化酶( AC) 活性及环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A( PKA) 含量的变化，旨在从AC-cAMP-PKA 信号通路探讨槟榔十三味丸抗抑郁作用机制。 　　1 材料 　　1. 1 动物 　　清洁级Wistar 雄性大鼠60 只，体重180 ～ 200 g，由斯贝福(北京) 实验动物科学技术有限公司提供，合格证号SCXK( 京)2011-0004。以清洁级大小鼠维持饲料饲养，由北京科澳协力饲料有限公司提供，合格证号京饲审(2009) 06166。动物饲养于北京中医药大学SPF 级动物房，整个实验过程中动物自由摄食和饮水(造模过程中禁食和禁水除外)，室温20 ～ 22 ℃(冷、热刺激除外)，相对湿度为60% ～ 70%，光照周期为12 h，7:00-19:00 光照，19:00-7:00 黑暗(昼夜颠倒刺激除外)。 　　1. 2 药物 　　槟榔十三味丸( 国药准字内蒙古蒙药股份有限公司，批号120805);盐酸氟西汀分散片(Patheon France 生产厂，产品批号2076A，分包装厂为礼来苏州制药有限公司，分包装批号2076AA);羧甲基纤维素钠(CMC-Na) ( 国药集团化学试剂有限公司，批;蔗糖( 北京化工厂，批。 　　1. 3 试剂与仪器 　　cAMP 放射性同位素免疫试剂盒(北京环亚泰克生物医学技术有限公司，批号2013061121); cAMP ( 美国Rapidbio 公司，批号201305122 ); PKA ( 美国Rapidbio 公司，批号201305173);考马斯亮兰G-250(南京建成生物工程研究所，批;Kontro-28Dgamma; 计数仪( 瑞士Kontro 公司);J2-21 低温离心机( 美国Beckman 公司);JY99-ⅢB 型超声器( 宁波新芝科器研究所);5415R 高速离心机(德国Eppendorf 公司);MultiskanMK3 型酶标仪(美国Thermo Scientific 公司);ELx50自动洗板机( 美国Biotek 公司);电子天平( 常熟市双杰测试仪器厂);1 /10 万ES125SM 电子天平( 瑞士precisa 公司);敞箱和电击足底箱(自制)。 　　2 方法 　　2. 1 分组和给药Wistar 雄性大鼠适应性喂养1周后禁水24 h，给予1%蔗糖水，测定1 h 内的消耗量，根据蔗糖水消耗量随机分为正常对照组、模型组、氟西汀组(3. 3 mg·kg - 1·d - 1 )、槟榔十三味丸低(0. 25 g·kg - 1·d - 1 )、中(0. 5 g·kg - 1·d - 1 )、高(1 g·kg - 1·d - 1)剂量组，每组10 只。正常对照组大鼠每笼5 只饲养，其他各组孤养。造模同时灌胃给药，正常对照组、模型组灌胃0. 5% CMC-Na，氟西汀组和槟榔十三味丸各组大鼠分别灌胃西药氟西汀、蒙药槟榔十三味丸，各组均按10 mL·kg - 1 体重给药，每周称一次体重，连续给药28 d。 　　2. 2 制备模型CUMS 结合孤养模型，参照文献[3-5]并略加改进，模型组、氟西汀组、槟榔十三味丸低、中、高剂量组大鼠共接受28 d 各种不同刺激，包括断食24 h，断水24 h，昼夜颠倒24 h，45 ℃热环境5 min，4 ℃ 冰水游泳5 min，夹尾1 min，电击足底(36 V 电压，每隔1 min 刺激1 次，每次持续10 s，共30 次)。 　　2. 3 RIA 法测AC 活性实验结束后，大鼠断头处死，剥离全脑，在冰盘上迅速分离出双侧海马及前额叶皮层，液氮速冻后- 70 ℃保存待测。将海马和前额叶皮层组织于4 ℃复温，取适量组织样品，按1∶ 40加入预冷的Tris-HCl 缓冲液(0. 05 moL·L - 1，pH7. 4)，在冰浴下充分研磨成组织混悬匀浆液。取适量匀浆液，用Bradford 法测定蛋白含量。反应总体积为500 mu;L，其中含有50 mmoL Tris-HCl 缓冲液，8 mmoL茶碱，4 mmoL D