超高效液相色谱-质谱结合主成分分析方法研究制川乌配伍前后的肠内菌代谢差异.pdfVIP

DOI: 10. 11895 / j. issn. 0253-3820. 140496 超高效液相色谱-质谱结合主成分分析方法研究 制川乌配伍前后的肠内菌代谢差异 李 雪 ,2 皮子凤 邢俊鹏 林 娜3 刘志强 宋凤瑞 1(中国科学院长春应用化学研究所,国家质谱中心(长春),吉林省中药化学和质谱重点实验室,长春 130022) 2(中国科学院大学,北京 100049) 3(中国中医科学院中药研究所,北京 100700) 摘 要 利用超高效液相色谱 质谱联用(UPLC MS)技术结合主成分分析方法研究制川乌单煎液 制川乌与 白芍 制川乌与防己共煎液在大鼠肠内菌中的代谢差异 采用 SIMCA P软件,以肠内菌代谢后乌头类生物碱 的相对含量为变量进行主成分(PCA)分析 在主成分得分图中,制川乌单煎液与制川乌 白芍 制川乌 防己 共煎液均可以明显区分,说明制川乌单煎液与制川乌 白芍 制川乌 防己共煎液的肠内菌生物转化存在显著 差异 通过主成分分析载荷图及独立样本 t检验,从制川乌 白芍组得到 7 种差异显著的标志物,从制川乌 防 己组得到 6 种标志物,其中制川乌 白芍组有 4 种标志物经肠内菌代谢后含量高于制川乌组,而制川乌 防己 组有 1 种化合物含量高于制川乌组,两组中其它标志物含量低于制川乌组 这些标志物可能是制川乌配伍前 后药效差异的物质基础 关键词 超高效液相色谱 质谱; 主成分分析; 制川乌; 药对配伍; 肠内菌 20 4-06-09 收稿; 20 4-09- 0 接受 本文系国家自然科学基金(No 8 073040, 8 274046)和国家重点基础研究发展计划 (Nos 20 CB505300, 20 CB505305) 资助项目 E- a l: song r@ c ac ac cn 1 引 言 制川乌(Radix Aconiti Preparata, RAP)为川乌的炮制品,是一种广泛用于治疗风湿性疾病的常用中 药,其主要化学成分为二萜类生物碱,该类化合物既是活性成分同时又具有一定的毒性[1] 中医理论 常通过配伍的方式达到减毒增效的目的 川乌与白芍、川乌与防己配伍是中医治疗风湿痹症的常用药 对,前者出自于汉代张仲景的乌头汤,后者最早见于唐代孙思邈的防己汤[2] 近年来,对于乌头与白芍 或防己药对配伍减毒增效的机理研究主要集中在镇痛、抗炎和免疫调节等药效学方面[3 ],而对于其药 理活性成分在发挥药效前生物转化情况却鲜有报道 经口服给药的中药在到达靶器官之前,其中的化学成分可能受到肠内菌群的作用而发生生物转 化[5] 因此,药物经肠内菌的代谢研究对阐明其生理作用机制具有重要意义 但是由于中药化学成分 的复杂性及代谢产物的多样性,多组样品代谢后差异的分析面临着巨大的挑战 本研究采用 UPLC-MS 技术对制川乌单煎液、制川乌-白芍共煎液、及制川乌-防己共煎液在大鼠肠内菌中代谢前后的乌头类生 物碱及其代谢产物进行了高效的分离鉴定,进而采用主成分分析方法对液质数据进行分析 首次从整 体原型及代谢产物的角度分析了白芍、防己对制川乌肠内菌生物转化的影响,为阐明制川乌与白芍、防 己配伍后减毒增效机理提供了新的依据 2 实验部分 2. 1 仪器与试剂 Accela UPLC高效液相色谱系统串联 FinniganLTQ XL离子阱质谱仪(美国 Thermo公司产品),配备 ESI电喷雾离子源; 手套式厌氧培养箱(美国 Thermo公司产品) 制川乌(四川江油); 白芍、防己(长春市吉林大药房); 利血平(美国 Sigma 公司); GAM 培养基 (日本日水公司); 甲醇、乙腈(色谱纯,英国 Fisher Scientific 公司); 乙酸乙酯(分析纯,北京试剂厂); 去离子水由 Millipore纯水仪制备 第 42 卷 2014 年 11 月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第 11 期 1646 ~ 1656 2. 2 样品溶液制备 称取 10. 0 g制川乌粉末,加蒸馏水 100 mL,浸泡 1 h,回流提取 2 次,每次 1 h,过滤,合并滤液,加入 95% (V / V)乙醇至终浓度为 50% ,静置 24 h,过滤,上清液于 65℃浓缩至 20 mL,得制川乌单煎液,备用 再称取制川乌粉末 10. 0 g,分别与白芍、防己粉末各 10. 0 g 混合,加蒸馏水 200 mL,浸泡 1 h,按上述方 法进行煎煮及浓缩,得到制川乌-白芍、制川乌-防己共煎液,备用 取 0. 5 mL 上述样品溶液,分别加入到含有 0. 4 g 大鼠新鲜粪便的 GAM 培养基中,培养终