大鼠嗅粘膜原代培养细胞的分类及细胞社会学特性研究.pdfVIP

江 苏 大 学 学 报 (医 学 版 ) 第 14卷 中枢神经系统中嗅觉系统非常独特 ，嗅粘膜 中 的嗅觉神经元具有不断更新的特点。嗅觉神经元死 亡后 ，由嗅上皮基底部 的神经 干细胞分化为新的嗅 细胞来补充 。新生嗅细胞的轴突生长进入嗅球有 赖于嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)的 正确引导，OECs为位 于嗅粘膜 固有层和 嗅球外层 的一种特殊的神经胶质细胞 ，兼有 星形胶质细胞和 雪旺氏细胞 的生物学特性 。OECs因其能引导 中枢神经系统的轴 突再 生 ，被认为是最有应用前景 的治疗 中枢 神经 系 统损 伤 的移植 供体 细胞 。 目前用于移植研究的 OECs主要为来源于嗅球的体 外培养的纯化细胞 。由于 OECs体 外培养和纯 化的方法 比较复杂且 细胞产率不高，加之嗅球 的材 料来源 困难 ，OECs的广 泛应 用受 到 一定 的限制。 本研究于成年大 鼠活体分离剪取部分 嗅粘膜 ，制成 细胞悬液接种于 F12培养基混合培养 ，以期建立成 年大鼠嗅粘膜 细胞 的体 外混合培养 及细胞分类方 法 ，探讨嗅粘膜的细胞社会学特性 ，为嗅粘膜混合细 胞群 自体移植治疗中枢神经系统损伤提供可行性研 究资料。 1 材 料和 方法 1．1 嗅粘膜的活体取材和细胞体外培养 成年 SD大鼠体 重 250～300 g，戊 巴 比妥钠腹 腔麻醉，消毒面部皮肤。在无菌条件下经一侧鼻孔 沿鼻腔向上至内眦部剪开皮肤及鼻骨 ，显露鼻 中隔 粘膜 ，用虹膜枪和眼科剪分离、剪取鼻中隔上三分之 一 嗅粘膜。创面充分止血 ，缝合皮肤。嗅粘膜取 出 后用 F12培养基(GIBCO公司产品)漂洗 3次去除 血迹后移至 O．25％胰酶中，用眼科剪充分剪碎并用 吸管吹打 ，制成嗅粘膜混合细胞悬液 ，用培养基终止 消化 ，离 心 清 洗 去 除 胰酶 。用 含 10％ 胎 牛 血 清 (GIBCO公司产品 )的 F12培养基将细胞浓度调至 1×10。／ml接种于无包被 的玻璃 培养皿 ，置 CO，培 养箱内(37℃ ，5％CO )培养。每 3天换液 1次。每 天观察细胞的生长情况 ，数码相机照相。 1．2 体外培养细胞的免疫细胞化 学染色 分别于体 外培养的第 1、7、14 d取 出含 嗅粘膜 细胞的培养皿 ，弃去培养液 ，PBS漂洗后用 4％多聚 甲醛 固定 24 h。分 别 用 nestin(Chemicon公 司 产 品)、NSE(博士德公 司产品)、GFAP(Antibody Diag— nostica公 司 产 品 )、NGFRp (Santa Cruz公 司 产 品)、vimentin(博 士德 公司产品 )及 laminin(博士德 公司产品)抗体对培养细胞进行免疫细胞化学染色。 2 结 果 2．1 嗅粘膜供体动物的术后存活情况 大 鼠经手术取 出部分 嗅粘膜后 ，手术切 口于 l 周内愈合。动物术后生长良好，并能长期存活。 2．2 嗅粘膜细胞的形态及生长特性 体外培养 嗅粘膜细胞 大部分 于 24 h内贴 壁。 首先贴壁的细胞 为成纤维细胞样细胞 ，多呈扁平多 边形 ，单层片状生长 ，形成基底饲养细胞层 (图 1)。 此后可见散在的球形细胞粘附于扁平细胞表面或直 接贴壁(图 2)，大部分球形 细胞分化 成梭形 的嗅鞘 样细胞，细胞成束排列(图 3)，方 向性较 为一致并出 现具有特征性的首尾相接现象(图 4)。于扁平细胞 之间偶见星形胶质细胞样 嗅鞘细胞 ，该细胞伸出细 长突起贴附于扁平 细胞上 (图 5)；少量球形细胞仍 然维持球形 并分裂 、增殖 (图 6)，逐 渐形 成克隆球 (图 7)。克隆球于 1周 内生长较快 ，随着球体增 大 其生长逐渐变慢 ，两周后直径至 1 mm左右，球体不 再生长。自克隆球周边有球形细胞 向外迁移，迁移 出的细胞 大多最 终分化 成 梭形 的嗅鞘样 细胞 (图 8)；少数分化成嗅细胞样细胞 ，后者胞体为卵圆形具 有两根突起 ，突起一根细长 ，多贴 附于梭形细胞上 ， 另一根较粗短 ，顶端隐约可见嗅毛(图 9)。 2．3 培养细胞标志蛋白的表达 2．3．1 vimentin染色结 果 首先贴壁 的单层扁平 基底细胞为 vimentin免疫 反应 阳性 细胞。阳性细 胞胞质内免疫反应产物呈丝状分 布 ，犹如树叶的叶 脉。从形态上判断该细胞为成纤维细胞(图 1)。 2．3、2 laminin染色结 果 laminin免疫 反应 阳性 细胞从形态上可分为两种类型 ，一种为位于基底 的 扁平细胞 ，其形态与 vimentin免疫反应 阳性细胞相 似 ，另一种为梭形 细胞 ，其形态 与 GFAP免疫 反应 阳性的嗅鞘细胞相似 (图 1O)。 2．3．3 nestin染