蛋白类药物生产选编.doc

PAGE  PAGE 300 蛋白类药物生产工艺 蛋白质类药物是生化药物中非常活跃的一个领域，目前的生化产品主要是从动物脏器或组织包括人的血液中分离而得。20世纪70年代后，人们开始应用基因工程技术生产一些蛋白质药物，已实现工业化生产的产品如胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、tPA、TNF等，现正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物发展。 第一节 主要蛋白质类药物的制备 蛋白质类药物主要包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式包括对机体各系统和细胞生长的调节、被动免疫、替代疗法等。 一、蛋白质激素类 蛋白质类激素主要包括垂体蛋白质激素、促性腺激素和其他蛋白质激素。其中垂体蛋白质激素包括 生长素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲状腺素(TSH)、促卵泡激素(FSH)等。促性腺激素包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、血清促性腺激素( SGH )等。其他蛋白质激素包括胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。 (一) 生长素(growthhormone，GH) 生长素是动物脑垂体前叶外侧的特异分泌细胞分泌的一种促进生长的蛋白质激素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病有很好的疗效。 人生长素（human growth hormone，hGH）由一条191个氨基酸的多肽构成的一链多肽的球形蛋白质，分子中含两条二硫键，分子量为21700，等电点4.9，沉降系数S20，W 2.179，其活性不需要整个分子结构，N端1～134氨基酸为活性所必需，C端的肽链起到保护作用，其化学结构与催乳素近似，故生长素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生长素作用。生长素包含大小两个环，以亲水球蛋白的形式存在。不同种类动物的生长素，其化学结构与免疫性质等都有较大差别。生长素的生产工艺有传统的方法和基因工程技术方法。 1．生长素的传统生产方法 传统方法是从脑垂体前叶分离纯化，其生产工艺见图11-1所示。 图11-1 提取法生产生长素的工艺路线 透析内液 提取 硫酸铵 pH5.5离心 上清夜 分级沉淀 硫酸铵 pH7.5 盐析沉淀 垂体前叶 透析内液 溶解除盐 透析 上清夜 盐析沉淀 盐析硫酸铵 pH4.0离心 除盐 透析 Tris-HCl缓冲液 除杂蛋白 离心 吸附DE-52 洗脱 Sephadex G-75 pH8.5 透析 硼砂-盐酸液 pH8.7 离子层析 DE-52 pH8.7 洗脱 硼砂-盐酸缓冲液 生长素 洗脱峰组分 冻干 （-30℃） 除盐 透析 脑垂体 前处理 透析内液 透析内液 活性组分 传统的工艺过程如下:  = 1 \* GB3 ① 材料获取 处死动物，立即解剖，取出脑垂体，冰上速冻，-20℃冷冻保存。  = 2 \* GB3 ② 预处理 脑垂体使用前，用蒸馏水冲洗数次，解冻，剥离前后叶。  = 3 \* GB3 ③ 匀浆 取动物垂体前叶，分割成小块，加水，用硫酸铵调pH至5.5，置组织捣碎机中匀浆。  = 4 \* GB3 ④提取 对匀浆以水抽提，10 000rpm离心30min；取沉淀，以pH 4.0的0.1mol／L硫酸铵溶液抽提，离心（同上），取沉淀，再用pH 5.5的0.25mol／L的硫酸铵溶液抽提，离心，取上清抽提液。  = 5 \* GB3 ⑤沉淀 调节抽提液pH 7.5，加饱和硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为lmol／L，离心，取上清液。  = 6 \* GB3 ⑥再沉淀 对上清液再加饱和硫酸铵溶液至1.8mol／L，离心，得沉淀。 ⑦除盐 将沉淀溶于少量蒸馏水中，对蒸馏水进行透析，得透析内液。 ⑧等电点沉淀 将所得透析内液用HCL或NaOH分别依次于pH 4.0和pH 4.9进行等电点沉淀以除去杂蛋白，离心、取上清液。 ⑨盐析 调上清液pH为4.0，加饱和硫酸铵溶液至浓度为1.25mol／L盐析，离心，得沉淀物。 ⑩除盐 将沉淀物溶于少量蒸馏水中，对含0.1mol／L氯化钠的Tris-HCL (pH 8.5) 缓冲溶液进行透析，得透析内液。 ⑩凝胶过滤 透析内液上Sephades G-75凝胶柱，用含0.1 mol／L氯化钠的50mmol／L Tris-HCL (pH 8.5 )缓冲溶液进行洗脱，分步收集，活性GH存在于第Ⅱ峰中。 ⑩透析 将活性峰部分对6.5mmol／L的硼砂-盐酸(pH 8.7)缓冲溶液进行透析，得透析内液。 ⑩层析 将透析内液上DEAE-C(DE-52)柱，用含0～0.3mol／L氯化钠的6.5mmol／L硼砂-盐酸 ( pH 8.0 ) 缓冲溶液进行梯度洗脱，合并活性峰，脱盐，冻干得GH。 2．人生长素的基因工程法 hGH的种属特异性很强，动物生长激