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植物生理学通讯 第41卷 第3期,2005年6月 36 5
教学园地 Teaching
关于茚三酮法测定脯氨酸含量中脯氨酸与茚三酮反应之探讨
李绍军 龚月桦 王俊儒 梁宗锁*
西北农林科技大学生命科学学院,陕西杨凌712100
测定脯氨酸含量的方法通常用磺基水杨酸或 述主要在植物生理学逆境指标测定脯氨酸含量实验
[1,2,9~12]
酒精提取再与酸性茚三酮反应生成稳定的红色产 中 。这些文献认为脯氨酸与酸性茚三酮反应
物,然后于波长520 nm处比色,通过标准曲线 生成红色物质,有互变异构体I和II(图2)。产物
或回归方程计算脯氨酸的含量。关于其测定原 在酸性条件下最大吸收峰520 nm,碱性条件下最
[10]
理,一些植物生理学实验指导明确指出:“在酸 大吸收峰630 nm。反应体系是醋酸缓冲液、水
性条件下,脯氨酸和茚三酮反应生成稳定的红色 合茚三酮、脯氨酸。
产物,用比色法于520 nm波长下测定脯氨酸的含
[1,2] [3~6]
量。” 然而,在各种生物化学教科书 中描述
氨基酸茚三酮反应时,则为:“在弱酸性条件
下,2个亚氨基酸——脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮
反应并不释放NH,而直接生成黄色化合物,其
3
结构式如图1,最大光吸收在440 nm。”为了对
两种教材中不同的说法进行比较,我们查阅了各
种文献,设计一些试验并进行了验证。
图2 红色产物互变异构体I和II
通过资料对比我们提出以下几个问题:(1)有
图1黄色产物 无氰化物对反应产生何种结果?(2)酸性体系以柠
檬酸为好还是醋酸为好?(3)产物在水相好还是甲
1两种说法的来源 苯相中更好?我们设计了相应试验并进行了验证。
关于黄色产物及其最大光吸收在440 nm的描 2验证试验
[3~6] -1
述广泛存在于国内生物化学教科书 和少数植物 实验中用到的试剂有:10g·mL标准脯氨
[7]
生理学实验指导 中,生化教科书一般没有指出 酸溶液、酸性茚三酮溶液(2.5 g茚三酮,加入60
该反应的具体反应体系,文献7在 “实验55”中 -1
mL冰醋酸和40 mL 2 mol·L 磷酸,于70℃下加
同意生化教科书的说法并有详细步骤,根据其中 热溶解,冷却后贮于棕色试剂瓶中备用)、分析
[8] -1
的参考文献我们发现其主要来源于Hyman的文 纯冰醋酸、0.2 mol·L pH 5.0的柠檬酸溶液、
献。文献8指出其反应体系由NaCN、醋酸缓冲 KCN。用各自不加脯氨酸的体系溶液调零,以龙
液、水合茚三酮组成,脯氨酸或羟脯氨酸与之反 尼柯(上海)仪器有限公司WFJ 7200型可见光分光
应后的产物是黄色的,最大吸收峰在440 nm。文 光度计测定可见光区域实验产物的吸收曲线。
献7来源是8,反应体系更改成为KCN、柠檬酸
缓冲液、水合茚三酮、脯氨酸。在文献7第3版[1]
收稿 2004-11-12修定 2005-01-27
中则取消了这个试验。
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