成体人牙髓干细胞分离与鉴定.pdf

成体人牙髓干细胞的分离与鉴定 杨雪超 樊明文 武汉大学口腔医学院(430079) email:yangxuecao@ 摘 要：目地从成人牙髓组织中分离培养牙髓干细胞，研究其生物学性状。 方法 选取年 青患者因正畸拔除的完好牙齿，取出牙髓，采用酶消化及过滤的方法得到单细胞悬液，有限 稀释法原代培养。扩大培养细胞克隆，体外诱导分化后对各克隆从碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性,矿化结节形成，牙本质唾蛋白表达，Hoechst33342 染色，Oil Red-O 染色，PPARr2 基因表达等方面进行检测。结果 在矿化液诱导下，克隆细胞呈现明显高的ALP 活性；能够形成矿化结节；可以分泌表达牙本质唾蛋白，已向成牙本质细胞方向发生了分化。 Hoechst33342 染色大部分细胞为阴性。成脂肪诱导后，Oil Red-O 染色阳性，检测到PPARr2 基因表达。结论 从成体人牙髓组织中可分离培养出干细胞，在体外能有效增殖且保持低分 化状态，能够进行分化，为进一步的深入研究奠定了基础。 关键词：成体人牙髓干细胞 牙本质唾蛋白 成牙本质细胞 1．引言 目前普遍认为，干细胞是具有无限或很强自我更新能力细胞，能分化产生至少一种高度分化 的后代细胞。干细胞应具有两个基本性质：（1）自我更新能力，能通过分裂维持自身群体的 稳定；（2 ）分化能力，在一定条件下能分化产生具有特定功能的细胞[1]。干细胞又分为胚 胎干细胞和成体干细胞两类，后者是目前研究的新热点。研究表明，皮肤[2]，乳腺[3]，肌 肉[4]，甚至神经组织[5]等成熟组织器官中都存在成体干细胞 （adult stem cell ）。最近，国外 学者证实成人牙髓组织中也存在干细胞[6]，国内关于此领域的研究尚刚刚起步，本文是系 列研究的第一步，旨在探寻一条分离牙髓干细胞的可靠途径，为更深入的研究奠定基础 2．材料和方法 2.1 材料 α-MEM 培养基，特极胎牛血清（ Hyclone, USA ）; collagenase type Ⅰ,dispase(Sigma,USA);ALP 检测试剂盒 （南京建成）；β-甘油磷酸钠 （进口分装）；兔抗人 DSP 抗体（NIDCR LW.Fisher 博士惠赠）；FITC 标记二抗（武汉博士德）；Oil Red-O ，IBMX, Hoechst33324(Sigma,USA) ；One-Step RT-PCR 试剂盒（Promage ） 2.2 方法 2.2.1 细胞培养和克隆 采用临床 19-29 岁因正畸或阻生需要拔除的健康第三磨牙，依照文献方法无菌条件下取 出完整牙髓[7] 。将牙髓剪碎，加入50 倍体积的0.2% collagenase type Ⅰ及0.2% dispase （体 积比 1 ︰1），37℃水浴摇床消化 1 小时，1000rpm/min 离心 10 分钟，去上清。培养液（含 20%胎牛血清）重悬沉淀，用100 μm 钢网过滤重悬液，获得单细胞悬液。细胞计数板计数 - 1 - 细胞浓度，调整后以 1－2 个细胞／孔的浓度接种于96 孔板，常规培养7-14 天，至出现细 胞克隆（细胞数≥50 为判定标准），扩大培养。 2.2.2 Hoechst33342 染色 成功扩大培养的细胞克隆，取其第四代接种于6 孔板，常规培养24 小时，更换培养液 （无血清的α-MEM ，含0.12 μg/ml Hoechst33342 ），37℃暗处孵育30 分钟后 1.5％冷福尔 马林固定15 分钟，冷PBS 充分漂洗。倒置荧光显微镜下340nm 波长光激发后观察荧光表达 情况，以正常牙髓成纤维细胞作为对照。 2.2.3 细胞的定向诱导分化 成功扩大培养的细胞克隆，待生长至90%汇集，0.15%胰酶消化后，以5x103/cm2 接种 于6 孔板和24 孔板。传代后第二天改为诱导液培养 （矿