高三生物选修一大肠杆菌的培养和分离.ppt

大肠杆菌的培养与分离 培养基是根据微生物生长繁殖时对营养物质的需要而配制的营养物质， 碳源、氮源、无机盐、水、生长因子 基础培养基： 营养培养基： 选择培养基： 鉴别培养基： 厌氧培养基： 基础培养基含有一般细菌生长繁殖所需要的基本营养物质； 营养培养基中加入糖，血清，酵母浸膏，生长因子等，适合营养要求高的细菌生长； 鉴别培养基含有特定的作用底物； 选择培养基中加入抑制某菌生长的物质，可促进另一种菌的生长，如肠道致病菌选择培养基：SS培养基； 厌氧培养基，如庖肉培养基，用于专性厌氧菌的培养。 选择培养基 加入青霉素的培养基分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基 分离导入了目的基因的受体细胞 加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基分离杂交瘤细胞 2、按物理状态可分为三种： 固体、半固体、 液体培养基。 固体平板的作用是分离、鉴定。 固体斜面的作用是保存菌种。 半固体培养基的作用是观察运动。 液体培养基的作用是扩大培养。 1．液体基础培养基 牛肉膏0.3g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g ，蒸馏水100ml，加热溶解以上成分，冷至40-50℃，调pH值至7.4~7.6，煮沸3-5分钟，补足水分，过滤、分装、高压灭菌。 2．半固体基础培养基 在液体基础培养基100ml中加琼脂0.2-0.5g，加热至100℃使琼脂熔化，分装试管，高压灭菌。取出后直立放置至琼脂凝固。 3．固体基础培养基 在液体基础培养基100ml中加琼脂2-3g，加热至100℃使琼脂化，分装于试管和三角烧瓶中，高压灭菌。取出后趁热将试管倾斜一定角度放置，琼脂凝固后即成普通琼脂斜面；将三角烧瓶中培养基倾注于灭菌平皿内，凝固后即成琼脂平板基础培养基。 3、培养基pH测定及矫正 材料： 待测培养基、 pH7.4标准比色管、4孔比色架、0.02％酚红、 氢氧化钠（0.1mol/L、1mol/L） 盐酸（0.1mol/L、1mol/L） 蒸馏水 试管（与比色管口径一致）、 刻度吸管（5ml、1ml、0.5ml、0.25ml）、 pH矫正 培养基制备的一般程序 细菌检验的操作需在无菌室或超净工作台内进行。 无菌室、超净工作台使用前后需进行消毒。 细菌检验使用的物品使用前后需严格灭菌 标本的采集 无菌试管、烧瓶的使用 4.接种前准备 用肥皂洗手并使用酒精消毒。 点燃酒精灯 →酒精棉擦拭双手 →酒精棉擦拭桌面 倒平板 接种、划线 灼烧接种环 →取菌液 →划线分离 接种、划线 灼烧接种环 →取菌液 →划线分离 接种、划线 为什么通过划线分离可得到单菌落？ 每划完一个区域要不要灼烧接种环？ 液体培养基 培养基灭菌 ★ 基础培养基： 121℃高压蒸汽灭菌15分钟 ★ 含糖培养基：90℃以上灭菌30分钟 ★ 鸡蛋、血清培养基：间歇灭菌3天3次 ★ 不耐高温的液体成分： G6玻璃砂漏斗滤过除菌 3.无菌环境 三、大肠杆菌的分离 消除污染杂菌、筛选高表达菌株 使用哪种培养基？ 配制培养基 包器材 灭菌 菌种扩增 倒平板 接种、划线 培养 观察记录 实验流程 烧至暗红 菌液膜 1、划线分离法 ① ④ ③ ② 一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的； 二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。 防止培养基蒸发的水蒸气凝结成水滴冲散菌落，影响对细菌的观察 (1).为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。 划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 (2).在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ (3).在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 2、涂布分离法 是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上