质粒中提仿单.doc

质粒中提实验步骤(E.Z.N.A. TM EndoFree Plasmid Midi Kit) 实验前准备 1. 使用前,将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。 2. 按下表用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存。 D6915-01: 加入80ml无水乙醇 D6915-03: 每瓶加入200ml无水乙醇 D6915-04: 每瓶中加入200ml无水乙醇 离心操作方案 1. 将带有质粒的E.coli 接种于30-50ml LB/抗生素培养液中，37°C 2. 取30-50ml的菌液，室温下3,500-5,000xg离心10min收集细菌。 3. 倒弃培养基。加入2.5ml Solution I/RNaseA混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮。 4. 往重悬混和液中加入2.5ml Solution Ii，轻轻颠倒混匀7-10 次后可将混合液室温放置2min以提高产量。避免剧烈混和裂解液且裂解反应不要超过5 min。 5. 加入1.25ml 冰浴Buffer N3，并温和颠倒离心管数次至形成白色絮狀沉淀。准备好过滤器。 6. 把HiBind中量柱套在收集管中，加入2ml Buffer GPS至柱子中，静置3-10min。室温3000- 5000xg离心5分钟。去滤液，把柱子重新放回收集管中。 7. 将裂解液倒进预先准备好的针筒过滤器中(针筒开口朝上，下面出口处接收集管)，静置2min。 8. 插入并轻推活塞使裂解液流进下面的收集管中。 9. 在过滤澄清的裂解液中加入1/10体积的ETR，颠倒7-10次后溶液变得浑浊，冰浴10-20min。 10. 42°C水浴5min后,25°℃ 11. 转移上清液移至离心管中，加入0.5倍体积无水乙醇(室温)，混匀后室温静置1-2min。 12. 将HiBind 中量柱裝在15ml收集管中。转移20ml混合液至柱子內，室温下3,000-5,000xg离心3-5 min，倒去滤液。 13. 重复该第12步骤，把剩余的过滤液转移至柱子，直至所有的溶液都从柱子滤出。 14. 把柱子重新装回收集管，加入3ml HB Buffer，按上述条件离心，弃滤液。 15. 把柱子重新装回收集管，加入3.5ml DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃滤液。 16. 重复步骤15一次。 17. 弃去滤液，把柱子重新装回收集管，最大速度（6000xg）离心10-15min以甩干柱子基质。 18. （可选）进一步干燥柱子,将柱子从收集管中取出，用真空抽滤装置抽干柱子10min后，也可 在真空烘箱或65°C 19. 把柱子装在干净的15ml离心管上，加入70°C预热的0.5-1ml Endotoxin free Elution Buffer到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），室温下静置2min后最大速度离心5min以洗脱DNA。