HPLC法测定甲肿消及大鼠血清中土贝母苷甲的含量论文.docVIP

　　HPLC法测定甲肿消及大鼠血清中土贝母苷甲的含量论文 .freelL,200 mg,60 μm)处理,甲醇洗脱；色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)和Easyguard保护柱；流动相：甲醇-水(65∶35),检测波长：214 nm,流速：1 mL/min。结果 甲肿消制剂及大鼠血清中土贝母苷甲的回收率分别为(103.49±3.49)%、(104.70±4.69)%,土贝母苷甲在1.18～88.5 μg/mL浓度范围内线性良好。每1 g制剂含土贝母苷甲995.3 μg,.freelL。结论 本方法快速、简便、准确,可用于测定制剂及其血清中土贝母苷甲的含量。 【关键词】 甲肿消；土贝母苷甲；固相萃取；反相高效液相色谱法；含药血清；含量测定 Key oside Ⅰ；SPE；RP-HPLC；drug containing serum；determination 甲肿消处方由夏枯草、土贝母等组成,按适当工艺制成浓度为3 g/mL原药材的浸膏剂。动物和临床试验证明,该制剂具有较好的化痰散结、治疗甲状腺功能亢进型甲状腺肿大的作用。但其作用途径与机理尚不清楚,故我们采用血清药理学的方法,观察本制剂大鼠灌胃给药后的含药血清对甲状腺细胞增殖的影响,以阐明本方治疗甲状腺功能亢进的机理。土贝母为葫芦科植物土贝母Bolbostemma paniculatum (Maxim.) Franquet的干燥块茎,有散结、消肿、解毒之功效。从中分离出的土贝母苷甲是其主要有效成分,具有抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等多种活性1。因此,我们采用RP-HPLC法建立了大鼠含药血清中的代表性成分土贝母苷甲(土贝母)的含量测定方法,为进一步阐明本方治疗甲状腺功能亢进的机理提供分析方法。 1 仪器与试药 LC-10A高效液相色谱仪和SPD-10A紫外检测器(日本导津公司)；XE215P型分析天平(Sartorius)；Diamonsil C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Easyguard保护柱(迪马公司)；固相萃取小柱(C18SPE,200 mg,3 mL,瓦里安公司)。体重(330±10)g的雄性L/kg的剂量灌胃给予甲肿消浸膏剂,10只按体重给予同剂量生理盐水,每天2次,连续7 d。末次灌胃后开始计时,于60 min后,用玻璃毛细管自乙醚麻醉大鼠眼底采血,收集血样于离心试管中,放置2 h促凝, 1 500 r/min离心10 min,吸取上清液,0.22 μm滤膜过滤,滤液即为含药血清和空白血清,-20 ℃冷冻保存。 2.2 甲肿消和大鼠含药血清中土贝母苷甲的含量测定 2.2.1 甲肿消样品的前处理 精密称取甲肿消浸膏约3 g,分别用甲醇(15、15、10 mL)超声(300 in,0.45 μm滤膜过滤,合并滤液,加甲醇定容至50 mL。精密量取10 mL,减压除去溶剂,残渣精密加入甲醇2 mL,超声溶解,0.45 μm滤膜过滤,取续滤液作为含量测试试液。 2.2.2 血清样品中土贝母苷甲的前处理 冻存血清于室温解冻备用。选取C18SPE柱(200 mg,3 mL,60 μm),先用2 mL甲醇冲洗,再用2 mL纯水冲洗活化；精密量取血清1 mL上样,弃去流出液,用2 mL纯水冲洗,再用1 mL甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液作为供试液。 2.2.3 色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Easyguard保护柱；流动相：甲醇-水(65∶35)；流速：1 mL/min；检测波长：214 nm；进样10 μL。色谱图见图1。 2.2.4 标准曲线的测定 精密称取土贝母苷甲标准品11.8 mg,用65%甲醇配成浓度为118 μg/mL的标准溶液,然后分别用65%甲醇稀释制成土贝母苷甲浓度为14.75、29.5、59、88.5、118 μg/mL,按“2.2.3”项色谱条件测定。以土贝母苷甲的峰面积A和浓度C作图,进行线形回归,得标准曲线方程：A＝2 503.1C－2 300.5,R2＝0.999 6,土贝母苷甲在14.75～118 μg/mL的浓度范围内线性良好。 取土贝母苷甲浓度为118 μg/mL的标准溶液,分别精密量取一定量,加入空白血清,使土贝母苷甲浓度为1.18、2.36、11.8、14.75、29.5、59、88.5 μg/mL,按“2.2.2”和“2.2.3”项操作,记录土贝母苷甲的峰面积。以峰面积A和浓度C作图,进行线形回归,得标准曲线方程：A＝2 458.2C＋2 127.8,R2＝0.999 3,血清样品中土贝母苷甲在1.18～88.5 μg/mL的浓度范围内线性良好。 2.2.5 精密度和回收率测定 取土贝母苷甲