原位聚合酶链式反应（insituPCR）和原位反转录聚合酶链-中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.12.7.62 原位聚合酶链式反应（in situ PCR ）和原位反转录聚合酶链式反应（in situ RT-PCR ）操作规程 （一）、仪器设备 英国Thermo Hybaid 原位PCR 仪。 （二）、操作流程 1 、原位PCR 步骤 1 ）预处理： （1）切片常规脱蜡； （2 ）0.2mol/L HCl 处理10min； （3 ）5 μg/ml 蛋白酶K 消化组织37℃10min； （4 ）Nase 消化组织37℃ 30min ； （5 ）梯度酒精脱水，室温干燥。 2 ）原位扩增： （1）切片滴加特异性序列引物30 μLPCR 扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石 蜡油封边； （2 ）PCR 热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共25～30 个 循环，72℃延伸10min； （3 ）氯仿洗去盖玻片，4 ％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脱水，干燥。 3) 原位杂交： （1）加地高辛标记探针的杂交液，98℃变性 10min，-20℃退火 5min，42 ℃ 杂交过夜。 （2 ）杂交后用2×SSC 洗涤10min，3 次，1×SSC 洗涤10min，3 次； （3 ）缓冲液洗涤10min，3 次； （4 ）加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h ； （5 ）缓冲液洗涤5min，3 次； （6 ）NBT 、BCIP 暗处显色，镜下控制，终止显色。 （7 ）常规脱水：透明、封固。 2 、原位RT-PCR 步骤 1 ）预处理： 中国试剂网 3.12.7.62 （1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54 ℃消化20min ，蒸馏水洗； （2 ）95℃加热3min，灭活残存的蛋白酶。 2 ）原位扩增： （1）在有RNA 酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应； （2 ）用热启动法进行PCR 扩增。标本加热至75℃时加上反应液，覆以盖玻 片，四周用指甲油密封。然后将温度升至95℃，2min 。再将热循环仪设定为95 ℃，45s ，55℃，1min 和75℃，45s ，共26 次循环； （3 ）扩增结束后，在80℃烤15min～30min 。 3 ）原位杂交： （1）杂交前标本95℃加热3min ； （2 ）加上杂交液，湿盒内50℃过夜；杂交液组成：25 ％硫酸葡聚糖，2×SSC ， 50 ％甲酰胺，0.33mg/ml 变性的鲑鱼精子DNA ， 每0 ．5mL 杂交液内含生物素 标记探针1ng。 （3 ）扩增的β-肌动蛋白和IL-6 用DAKO 检测试剂盒K600(链霉卵白素，生 物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测。阳性反应呈紫色。