第五章透射电子显微镜生物样品制备技术.pptVIP

（3）、包埋时的注意事项 A、包埋的容器一定要干燥。 B、所有药品要注意防潮，最好存放在干燥器 中。 C、配制包埋剂时，每加一种药品要充分搅拌 均匀后，在加另一种药品。 D、配好的包埋剂不能有气泡。 E、聚合好的包埋块要存放在干燥器中，以防 止受潮。 五、超薄切片 包埋聚合结束，组织和包埋剂成为一体的、具有一定硬度的包埋块了。在进行超薄切片之前，还需完成包埋块的修整、在支持铜网上做上支持膜、制作玻璃刀等工作。 1、包埋块的修整：包埋块的修正有人工修块方法和机械修块法。人工修块，是用单面刀片对包埋块进行修整，一般操作熟练的技术人员，都是用这种方法。 机械修块法是用修块机修块，这种方法修出的包埋块形状规则，但修快速度很慢，熟练者一般不用。不管采用哪种方法，修正好的包埋块的形状应如下图所示： 修块机 2、支持膜的制备 （1）、铜网的选择及清洗：超薄切片必须捞在特制的金属载网（其作用如同石蜡切片的载玻片）上，才能在电镜下观察。电镜使用的载网，根据制作材料的不同有多种。如尼龙网、铜网、镍网等，它们的大小都是相同的，一般直径为3毫米。各种材质的载网根据在上面存有的网眼的多少不同，可分为单孔、双孔、多孔、100目、 200目、300目…… 1000目。在生物样品 制备中经常用的载网 是200目铜网。 A、铜网的清洗：新铜网在使用前先用丙酮浸泡，再用酒精洗几次，然后放在铺有干净滤纸的培养皿中干燥备用。 一些使用过的旧铜网，先在二氯乙烷中浸泡30分钟，然后用超声波清洗器处理2～5分钟，再用二氯乙烷洗几次，换酒精再超声洗一次，用无水酒精洗2次，放培养皿中干燥。 B、支持膜的制作：在干净的载网上覆盖上一层薄膜，用以支持所要观察的切片，这层膜就叫支持膜。支持膜的厚度一般为20nm. 支持膜有碳膜、火棉胶膜和Formva（聚乙烯醇缩甲醛）膜，最 常用的是Formvar膜。 Formvar膜的制作方法：先配制0.2％～0.5％的Formvar二氯乙烷（或氯仿）溶液。取一直径8cm的结晶皿（或培养皿）盛满蒸馏水，把一干净光滑的载玻片（或制刀用的玻璃条）浸入上述溶液中，然后垂直提出，放置在干燥（相对湿度不能高于30％）的地方，干燥后载玻片上就结有一层薄膜。用锋利的刀片在载玻片的边缘将膜划破。然后将带膜的玻片的前端与水面呈45度角与结晶皿中的水接触，并慢慢向水中压玻片，这时由于水的张力作用，膜会逐渐脱离玻片漂于水的表面，取出玻片。将干净的铜网有光泽的一面向着漂在水面上的膜，均匀的摆放在膜上，然后用一与膜等宽的擦镜纸，平整的放在带有铜网的模上，等水完全湿透纸，用镊子将纸提出，带有支持膜的铜网就沾在纸上。将有铜网面向上放在干净的培养皿中干燥备用。 具体过程见下图示： 火棉胶膜和碳膜因为一般不用，其制作方法在此不作介绍。有兴趣者可看有关的参考书。 3、玻璃刀的制作：在超薄切片技术中，所用的切片刀有两种，一种是钻石刀，它价格昂贵，常用于硬质材料的切片（如植物、动物的骨骼材料等）；另一种是最常用的玻璃切片刀。制作玻璃刀用的玻璃是特制的专用玻璃，要求含硅量达到75％以上，无杂质，无气泡，光洁度好，厚度在4～6.5mm。宽度是25mm的玻璃条。 制作玻璃刀有两种方法，即手工制作法和制刀机制作法，手工制作法成功率很低，一般不用，各电镜室都用制刀机来制作玻璃切片刀。制刀机的结构见下图所示。 LKB的制刀机 LKB制刀机模式图 * * 第五章 透射电子显微镜生物 样品的制备技术 通过前段的学习大家已知到，电子显微镜可分为透射和扫描两种，它们的成像原理是完全不同的。透射电镜的成像是和光学显微镜的原理基本相同，因此它只能观察薄片样品和微颗粒样品，它主要是用来观察研究组织或细胞的内部超微结构。而扫描电镜是电子束在样品表面扫描激发出的二次电子转换成样品的图像，它既可以观察较大的块状样品也可观察颗粒样品。但它只能观察研究样品的表面形态结构。所以两种电镜的样品制备方法是完全不同的。 第一节 透射电子显微镜